Un procedimiento para el pronóstico de la supervivencia de un paciente que comprende:

a) enriquecer inmunológicamente una fracción de una muestra de sangre de dicho paciente, comprendiendo dicha muestra una población de células mixtas sospechosas de contener células tumorales circulantes (CTC), en donde dicha etapa de enriquecimiento comprende mezclar dicha muestra con partículas magnéticas acopladas a un anticuerpo que se une específicamente a EpCAM y someter dicha mezcla de partículas magnéticas-muestra a un campo magnético para producir una suspensión celular enriquecida en CTC unidas a partículas magnéticas, b) confirmar la integridad estructural de las CTC positivas para citoqueratina de que se encuentran intactas, en donde las células positivas para citoqueratina se identifican mediante el marcaje con un anticuerpo monoclonal para citoqueratina, y en donde dicha integridad estructural se determina mediante un análisis de las características morfológicas basado en fluorescencia, y c) medir el número de dichas CTC intactas para determinar la supervivencia del paciente, en donde un número de CTC por encima o igual a cinco CTC por 7,5 ml de sangre es indicativo de un pronóstico de supervivencia más bajo

Antecedentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al pronóstico del cáncer y a la supervivencia en pacientes de cáncer metastásico, basándose en la presencia de células cancerígenas circulantes (CTC) morfológicamente 5 intactas en sangre. Más específicamente, se describen procedimientos diagnósticos, reactivos y aparatos que correlacionan la presencia de células cancerígenas circulantes en 7,5 ml de sangre de pacientes con cáncer de mama metastásico con el tiempo de evolución de la enfermedad y la supervivencia. Las células tumorales circulantes se determinan mediante metodologías muy sensibles capaces de aislar y tomar imágenes de 1 ó 2 células cancerígenas en de 5 a 50 ml aproximadamente de sangre periférica, el nivel del recuento de células tumorales y el incremento en el 10 número de células tumorales durante el tratamiento se correlacionan con el tiempo de evolución, el tiempo hasta la muerte y la respuesta a la terapia.

Antecedentes de la técnica

A pesar de los esfuerzos para mejorar el tratamiento y la gestión de pacientes con cáncer, la supervivencia en pacientes con cáncer no ha aumentado en las dos últimas décadas para muchos tipos de cáncer. Por consiguiente, la 15 mayoría de pacientes con cáncer no mueren a causa de su tumor primario, sino que sucumben por metástasis: múltiples colonias tumorales muy extendidas establecidas por células malignas que se desprenden del tumor original y viajan por el cuerpo, a menudo a sitios distantes. La estrategia terapéutica de mayor éxito en el cáncer es la detección temprana y la extracción quirúrgica del tumor mientras aún está confinado en el órgano. La detección temprana del cáncer ha demostrado ser factible para algunos cánceres, particularmente donde existen pruebas diagnósticas 20 apropiadas tales como frotis de PAP en cáncer cervical, mamografía en cáncer de mama, y antígeno sérico específico de la próstata (PSA) en cáncer de próstata. No obstante, muchos cánceres detectados en fases tempranas ya han establecido micrometástasis antes de la resección quirúrgica. Así, es importante la determinación temprana y precisa del potencial maligno del cáncer para la selección de la terapia adecuada.

La terapia óptima estará basada en una combinación de información diagnóstica y del pronóstico. Es 25 necesaria una prueba diagnóstica precisa y reproducible para proporcionar información específica con respecto a la naturaleza metastásica de un cáncer particular, junto con una evaluación del pronóstico que proporcionará información específica con respecto a la supervivencia.

Una prueba de pronóstico bien diseñada proporcionará información a los médicos sobre el riesgo y la probabilidad de supervivencia, que a su vez beneficia al paciente al no tener que soportar un tratamiento innecesario. 30 También se estimulará el ánimo del paciente al saber que una terapia seleccionada será eficaz basándose en una prueba de pronóstico. El ahorro asociado a esa prueba puede ser significativo puesto que proporciona al médico una justificación para la sustitución de terapias ineficaces. Obviamente, un banco de datos diagnósticos y pronósticos bien desarrollado en el tratamiento y la detección de cáncer metastásico centrado en la supervivencia sería un beneficio enorme para la medicina (documento de EE.UU. 6.063.586). 35

Si un tumor primario se detecta suficientemente temprano, a menudo se puede eliminar por cirugía, radiación, o quimioterapia o alguna combinación de estos tratamientos. Desafortunadamente, las colonias metastásicas son difíciles de detectar y eliminar y a menudo es imposible tratarlas a todas ellas con éxito. Por tanto, desde un punto de vista clínico, la metástasis se puede considerar el acontecimiento concluyente en la progresión natural del cáncer. Además, la capacidad para metastatizar es una propiedad que caracteriza de manera única a un tumor maligno. 40

Antígeno tumoral soluble:

Basándose en la complejidad del cáncer y a la metástasis del cáncer y la frustración en el tratamiento de pacientes con cáncer a lo largo de los años, se han llevado a cabo numerosos intentos para desarrollar pruebas diagnósticas que guíen el tratamiento y controlen los efectos de ese tratamiento sobre la metástasis o la recidiva.

Uno de los primeros intentos para desarrollar una prueba útil para la oncología diagnóstica fue la formulación 45 de un inmunoensayo para el antígeno carcinoembrionario (CEA). Este antígeno aparece en células fetales y reaparece en células tumorales en ciertos cánceres. Se han llevado a cabo esfuerzos exhaustivos para evaluar la utilidad de pruebas para el CEA, así como muchos otros antígenos "tumorales", tales como el antígeno específico de la próstata (PSA), CA 15.3, CA 125, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), CA 27.29, p27 que se encuentran en muestras de tejido o en sangre como restos celulares solubles. Se cree que éstos y otros antígenos de restos 50 celulares proceden de la destrucción de las células tumorales circulantes y no circulantes, y por lo tanto su presencia no siempre refleja el potencial metastásico, especialmente si la ruptura de las células se produce mientras están en un estado de apoptosis.

Pruebas adicionales usadas para predecir la progresión del tumor en pacientes con cáncer se han centrado en la correlación de índices enzimáticos como la actividad de la telomerasa en muestras tumorales obtenidas por biopsia con una indicación de un pronóstico favorable o desfavorable (documento de EE.UU. 5.693.474; documento de EE.UU. 5.639.613). La evaluación de la actividad enzimática en este tipo de análisis puede suponer el uso de procedimientos de laboratorio que requieren mucho tiempo, tales como electroforesis en gel y análisis de transferencia 5 de Western. Además, hay variaciones en la relación señal a ruido y en la sensibilidad en el análisis de muestras basándose en el origen del tumor. A pesar de estas deficiencias, los marcadores tumorales específicos solubles en sangre pueden proporcionar una aproximación rápida y eficaz para el desarrollo de una estrategia terapéutica al comienzo del tratamiento. Por ejemplo, la detección de HER-2/neu sérico y CA 15-3 sérico en pacientes con cáncer de mama se ha demostrado que son factores pronósticos del cáncer de mama metastásico (Ali S.M., Leitzel K., Chinchilli 10 V.M., Engle L., Demers L., Harvey H.A., Carney W., Allard J.W. y Lipton A., Relationship of Serum HER-2/neu and Serum CA 15-3 in Patients with Metastatic Breast Cancer, Clinical Chemistry, 48(8):1314-1320 (2002)). El aumento de HER-2/neu da lugar a una disminución de la respuesta a la terapia hormonal, y es un factor pronóstico significativo en la predicción de respuestas a cáncer de mama metastásico positivo para el receptor de la hormona. Así, en las neoplasias malignas donde está asociado el producto del oncogén HER-2/neu, se han descrito procedimientos para 15 supervisar la terapia o evaluar los riesgos basándose en niveles elevados (documento de EE.UU. 5.876.712). Sin embargo, en ambos casos, los niveles iniciales durante la remisión, o incluso en individuos sanos, son relativamente altos y pueden solaparse con las concentraciones que se encuentran en los pacientes, por lo que requieren múltiples pruebas y vigilancia para establecer niveles iniciales y niveles límite que dependen del paciente.

En el cáncer de próstata, los niveles de PSA en suero han demostrado ser útiles en la detección temprana. 20 Cuando se utiliza con un examen de seguimiento físico (tacto rectal) y biopsia, la prueba del PSA ha mejorado la detección del cáncer de próstata en una etapa temprana, cuando se trata mejor.

Sin embargo, las pruebas del PSA, o del PSMA relacionado, dejan mucho que desear. Por ejemplo, niveles elevados de PSA se correlacionan débilmente con el estadio de la enfermedad y no parecen ser un indicador fiable del potencial metastásico del tumor. Esto puede deberse en parte al hecho de que el PSA es un componente del tejido 25 normal de la próstata y del tejido de la hiperplasia prostática benigna (BHP). Por otra parte, aproximadamente el 30% de los pacientes con presunto cáncer de próstata localizado y bajas concentraciones correspondientes de PSA sérico, pueden presentar enfermedad metastásica (Moreno y col., Cancer Research, 52:6110 (1992)).

Marcadores genéticos:

Una aproximación para determinar la presencia de células malignas del tumor de próstata ha sido la prueba 30... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el pronóstico de la supervivencia de un paciente que comprende:

a) enriquecer inmunológicamente una fracción de una muestra de sangre de dicho paciente, comprendiendo dicha muestra una población de células mixtas sospechosas de contener células tumorales circulantes (CTC), en donde dicha etapa de enriquecimiento comprende mezclar dicha muestra con partículas magnéticas acopladas a un anticuerpo que se une específicamente a EpCAM y someter dicha mezcla de partículas magnéticas-muestra a un 5 campo magnético para producir una suspensión celular enriquecida en CTC unidas a partículas magnéticas,

b) confirmar la integridad estructural de las CTC positivas para citoqueratina de que se encuentran intactas, en donde las células positivas para citoqueratina se identifican mediante el marcaje con un anticuerpo monoclonal para citoqueratina, y en donde dicha integridad estructural se determina mediante un análisis de las características morfológicas basado en fluorescencia, y 10

c) medir el número de dichas CTC intactas para determinar la supervivencia del paciente, en donde un número de CTC por encima o igual a cinco CTC por 7,5 ml de sangre es indicativo de un pronóstico de supervivencia más bajo.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho pronóstico de supervivencia se determina en pacientes con cáncer de mama metastásico, pacientes con cáncer de próstata metastásico y/o pacientes con cáncer de colon metastásico. 15