Un procedimiento para detectar y enumerar una población diana dentro de una muestra biológica,

que comprende:

(a) etiquetar dicha población objetivo dentro de dicha muestra biológica con un marcador fluorescente en el que dicho marcador es específico para dicha población diana;

(b) acoplar dicha población diana a una partícula magnética;

(c) añadir un flotador que contiene un imán permanente pequeño directamente a dicha muestra;

(d) permitir que el flotador se estabilice a lo largo de la ventana de visión de la cámara;

(e) adquirir una imagen de dicha población diana, y

(f) analizar dicha imagen para detectar y enumerar dicha población diana etiquetada.

Procedimiento y aparato de formación de imágenes de componentes diana en una muestra biológica usando imanes permanentes.

Campo de la invención La invención se refiere generalmente a la formación de imágenes de componentes diana en una muestra fluida (biológica) . Más específicamente, se describen procedimientos y aparatos que permiten la selección positiva de células dianas en una muestra de sangre. Los imanes permanentes pequeños se añaden directamente a una muestra de sangre que contiene CD4 inmunomagnéticamente etiquetado y sangre total tintada fluorescentemente con Naranja de Acridina (NDA) .

Técnica Anterior

El uso de la tecnología de separación inmunomagnética proporciona una mayor sensibilidad y especificidad en la detección de entidades dianas en sangre, por ejemplo, pero sin limitar a, células cancerígenas que circulan intactas y células endoteliales. Esta herramienta de diagnóstico simple y sensible, como la descrita (en los documentos US 6.365.362; US 6.551.843; US 6.623.982; US 6.620.627; US 6.645.731; WO 02/077604; WO 03/065042; y WO 03/019141) puede usarse en la presente invención para correlacionar la supervivencia estadística de un paciente individual en base a un nivel límite.

Una herramienta de diagnóstico anterior incorpora una muestra de sangre de un paciente con cáncer (documento WO 03/018757) incubada con microesferas magnéticas, cubierta con anticuerpos dirigidos contra un antígeno con superficie de célula epitelial como por ejemplo EpCAM. Después de etiquetar con nanopartículas magnéticas cubiertas con anti-EpCAM, las células magnéticamente etiquetadas se aíslan después usando un separador magnético. La fracción inmunomagnéticamente enriquecida se procesa además para el análisis inmunocitoquímico corriente abajo o citometría de imagen, por ejemplo, en el Sistema CellSpotter o CellTracks® (Immunicorn Corp., USA) . La fracción magnética puede también usarse para análisis inmunocitoquímico corriente abajo, RT-PCR, PCR, FISH, citometría de flujo, u otros tipos de de imagen.

El Sistema CellSpotter o CellTracks® utiliza la selección y separación inmunomagnética para enriquecer y concentrar en alto grado todas las células epiteliales presentes en muestras de sangre total. Las células capturadas se etiquetan de manera detectable con un marcador específico de leucocito y con uno o más anticuerpos monoclonales fluorescentes específicos de célula tumoral para permitir la identificación y enumeración de las CTCs capturadas así como la diferenciación instrumental o visual de las células contaminantes no dianas. A una sensibilidad de 1 ó 2 células epiteliales por 7, 5 ml de sangre, este ensayo permite la detección de células tumorales incluso en las primeras fases de masa baja tumoral.

El sistema EasyCount® (documento PCT/US03/04468) es un sistema de formación de imágenes fluorescente para hacer una distinción entre linfocitos, granulocitos y monocitos. El sistema incluye instrumentos ópticos electrónicos compactos, procedimientos analíticos, adquisición de imágenes, y algoritmos de reducción de datos para la detección y enumeración de células o partículas dianas magnéticamente etiquetadas. Usando sangre total como un ejemplo, las células sanguíneas se etiquetan fluorescentemente usando uno o más tintes fluorescentes específicos de la diana, tales como un tinte para tinción de ADN. Las células de interés o células dianas en la muestra se sangre se etiquetan mediante incubación con anticuerpos monoclonales en una cámara apropiada de detección óptica o cubeta, que a su vez está colocada en un gradiente de campo magnético que selectivamente provoca que las células magnéticamente etiquetadas se muevan hacia la superficie plana de visión de la cámara. Las células dianas se recogen e inmovilizan sustancialmente uniformemente sobre la superficie ópticamente transparente de la cámara. Un segmento de esta superficie y las células dianas etiquetadas sobre el mismo se iluminan por medio de uno o más LEDs (diodos emisores de luz) . Posteriormente, un CCD (dispositivo de carga acoplada) captura la luz emitida por las células dianas individuales. Los procedimientos de adquisición de imágenes, los procedimientos de procesamiento y algoritmos, desvelados en el presente documento, se usan para contar el número de células emisoras de luz capturadas y para relacionar la salida de datos con las células dianas por microlitro de la muestra del análisis en la cámara y finalmente con la muestra original.

Los procedimientos actualmente disponibles no proporcionan medios rápidos, de bajo coste y consistentemente fiables para calcular una población diana de células mediante citometría de flujo o citometría de imagen. Por lo tanto, hay una clara necesidad de una detección rápida y precisa de componentes dianas en sangre tales como células cancerígenas o endoteliales.

Resumen de la invención

La presente invención es un procedimiento y medios para la selección positiva y la formación de imágenes de entidades dianas. Esto incluye un dispositivo magnético permanente cubierto para la manipulación magnética en el sistema de la presente invención. El sistema concentra inmunomagnéticamente la entidad diana, la etiqueta fluorescentemente, identifica y cuantifica las células dianas mediante enumeración positiva. El análisis estadístico posterior permite al clínico obtener información potencial del diagnóstico.

Más específicamente, la presente invención proporciona el aparato, los procedimientos y los kits para diagnosticar trastornos enfermos después de la formación de imágenes inmunomagnética. Después de obtener una muestra de sangre total de un paciente, se añade un pequeño imán permanente a la muestra de sangre total. A diferencia de la configuración CellSpotter Magnest previamente descrita, un imán de NdFeB pequeño se añade directamente a un recipiente de la muestra, por ejemplo el cartucho CellTracks® , documentos US 6.861.259 y US 7.011.794, con 100 μl de CD4 inmunomagnéticamente etiquetado y sangre total tintada fluorescentemente con NDA. Después de 10 minutos el imán permanente pequeños se extrae de la muestra usando una varilla de hierro u otro imán. El imán se coloca dentro del recipiente para permitir el análisis de la imagen.

La presente invención tiene el imán fijado a un dispositivo de flotación (flotador) dentro de la cámara de reacción. Después de la adición de los reagentes, la sangre y el flotador, las células dianas inmunomagnéticamente etiquetadas se colocan a lo largo de un único plano de formación de imágenes para su análisis, todas dentro de la cámara de reacción.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Etapas en la formación de imágenes inmunomagnética de células dianas usando el cartucho CellSpotter como el recipiente de la formación de imágenes.

Figura 2: Representación esquemática de una realización del imán pequeño. El panel 1 muestra la entidad diana (células) . El panel 2 muestra la entidad diana orientada sobre el imán cubierto con goma de silicona PDMS.

Figura 3: (A) muestra el diseño del flotador con el imán permanente fijado a una cara. (B) muestra el flotador dentro de una cámara tubo que tiene una ventana plana ópticamente transparente para la formación de imágenes.

Figura 4: (A) es una imagen de microesferas fluorescentes sobre la cara del flotador. La cara tiene un grosor de 0, 17 milímetros. (B) es una imagen de microesferas magnéticas sobre la cara del flotador. La cara tiene un grosor de 0, 7 milímetros.

Figura 5: (A) muestra una imagen de células CD14-FF seleccionadas después de la tinción con Naranja de Acridina (mostradas en verde) y CD45-APC (mostradas en rojo) . (B) De izquierda a derecha, el flotador, el tubo con la cámara que tiene una línea para marcar el volumen, y la tapa de la cámara.

Figura 6: Imágenes fluorescentes adquiridas usando tres objetivos diferentes. (A) Imagen adquirida usando un objetivo 5x NA 0, 12. (B) Imágenes adquiridas usando 10x NA 0, 25 y una (C) imagen usando un objetivo 40x NA 0, 6. El color azul representa DAPI, el verde es CD8-PE y el rojo es CD4-APC.

Figura 7: Imágenes obtenidas por dos procedimientos. (A) muestra los resultados obtenidos después de 40 rotaciones usando el procedimiento 1. (B) muestra los resultados del procedimiento 2, obtenidos después de 500 rotaciones.

Figura 8: Imágenes obtenidas con un objetivo 5x y 40x con la adición de 20, 40, 60 y 80 microlitros de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar y enumerar una población diana dentro de una muestra biológica, que comprende:

(a) etiquetar dicha población objetivo dentro de dicha muestra biológica con un marcador fluorescente en el que dicho marcador es específico para dicha población diana;

(b) acoplar dicha población diana a una partícula magnética;

(c) añadir un flotador que contiene un imán permanente pequeño directamente a dicha muestra;

(d) permitir que el flotador se estabilice a lo largo de la ventana de visión de la cámara;

(e) adquirir una imagen de dicha población diana, y

(f) analizar dicha imagen para detectar y enumerar dicha población diana etiquetada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha población diana son células que expresan CD4.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el imán permanente pequeño es de neodimio.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el imán permanente pequeño es un disco que tiene un diámetro de aproximadamente 1, 6 mm y una altura de 0, 8 mm.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el imán permanente pequeño está cubierto por silicona PDMS.

6. Un dispositivo para detectar y enumerar una población diana dentro de una muestra biológica, que comprende:

(a) un tubo de recogida de muestra en el que dicho tubo tiene una superficie plana y en el que la superficie plana está configurada como una superficie óptica de visión para representar una población diana usando un microscopio convencional de fluorescencia;

(b) un flotador que contiene un imán permanente dentro de dicho tubo en el que el imán permite la colocación de dichas células dianas etiquetadas a lo largo de un único plano de formación de imágenes para su análisis; y

(c) un tapón para dicho tubo de recogida.

7. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que el imán es un disco que tiene un diámetro de aproximadamente 1, 6 mm y una altura de 0, 8 mm.

8. El procedimiento de la reivindicación 1 y el dispositivo de la reivindicación 6, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre.