Un dispositivo de obtención de imágenes de diagnóstico para análisis de células raras circulantes.

Un sistema automatizado de obtención de imágenes para laboratorio clínico para detectar células raras a partir de una muestra biológica,

que comprende:

a. un sistema de iluminación que comprende una cámara CCD, un conjunto de óptica de iluminación, objetivo, cubos de filtro, lámpara con alojamiento, y un conjunto de obturador/filtro ND;

b. un conjunto de etapa X-Y-Z movido por medio de un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capacitados para proporcionar una resolución de 0,2 micrones y que tienen una plataforma para posicionar un dispositivo magnético y un cartucho de muestra para la obtención de imágenes;

c. un sistema de detección fluorescente que tiene una pluralidad de cubos de filtro movidos por medio de un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capacitados para proporcionar una resolución de 0,2 micrones, y

d. un ordenador con periféricos relacionados en el que a, b, c y d del sistema forman una estructura compacta y autocontenida.

Un dispositivo de obtención de imágenes de diagnóstico para análisis de células raras circulantes.

Campo de la invención La invención se refiere en general al campo de la obtención automatizada de imágenes de una muestra, y más en particular a la citometría de imagen de células raras aisladas a partir de fluidos corporales mediante un dispositivo automatizado para análisis relacionado con el diagnóstico, la monitorización y la gestión de enfermedades específicas, en particular el cáncer.

Técnica anterior

Las células tumorales están presentes con frecuencia en la sangre de pacientes con carcinoma a frecuencias muy bajas (<10 células por ml) . Estos niveles pueden proporcionar información clínicamente útil. Sin embargo, los laboriosos procedimientos requeridos para detectar y cuantificar la presencia de células tumorales circulantes y las estadísticas de números bajos, introducen un alto nivel de variabilidad en los resultados. El sistema de la presente invención mejora los dispositivos de obtención de imágenes usados en los laboratorios clínicos para la detección de células raras en muestras de fluidos tales como muestras de sangre (es decir, células tumorales raras circulantes de origen epitelial) .

En general, estas células raras son objetivadas mediante etiquetado y separación de la sangre con medios magnéticos. Las células capturadas son etiquetadas fluorescentemente para permitir la detección y la diferenciación de las células no etiquetadas y de las células de control. Cell Spotter® es un microscopio de fluorescencia semiautomatizado que enumera y diferencia entre células seleccionadas inmuno-magnéticamente en base a señales de fluorescencia procedentes de células de la muestra de sangre.

Una muestra de sangre sospechosa de contener las células raras objetivadas, es pre-procesada enriqueciendo las células raras deseadas. El enriquecimiento se obtiene enlazando anticuerpos, específicos para la célula objetivo, a partículas magnéticas. El complejo inmunomagnético se combina con la muestra de sangre en presencia de una campo magnético, proporcionando la captura inmunomagnética de las células objetivo. Tras la obtención de una fracción de sangre enriquecida que contiene la célula objetivo, se añaden reactivos fluorescentes para la posterior formación de imágenes. Las células enriquecidas se colocan en un cartucho de visión que se sitúa a continuación en un dispositivo magnético que dirige células etiquetadas magnéticamente en la muestra a una superficie planar ópticamente clara de la cámara para alineamiento inmunomagnético y análisis de imagen. La nueva cámara de muestra (documentos US 10/074.900 y US 10.303.309) utilizada en la presente invención y el sistema Cell Spotter® están incorporados en las patentes y solicitudes en tramitación siguientes: US 5.186.827, US 5.698.271, US 6.120.856, US 6.551.843, US 09/702.188, US 10/449.335. El dispositivo magnético y la cámara se colocan a continuación en un microscopio de fluorescencia equipado con un selector de filtro controlado por ordenador y una etapa X-Y-Z controlada digitalmente. Las imágenes son adquiridas mediante exploración del cartucho de muestra con 4 conjuntos de filtro fluorescentes diferentes. Las imágenes adquiridas son procesadas mediante análisis de software automatizado para compilar datos que contengan imágenes de las células objetivo. Se ven los fotogramas individuales y se seleccionan manualmente en cuanto a células objetivo. El análisis se completa con una presentación de una galería de imágenes que contienen todas las células objetivo seleccionadas.

Cuando se incorpora en un laboratorio clínico, el sistema puede ser usado para examinar células raras circulantes asociadas a una enfermedad clínica. Por ejemplo, se pueden establecer fácilmente ensayos clínicos longitudinales, de prospectiva multi-centro, en los que el número de células tumorales circulantes (CTC) está correlacionado con la progresión de la enfermedad en pacientes que tengan cáncer de pecho metastático (documentos US 6.365.362; US 6.645.731; US 10/079.939) .

De ese modo, los conceptos principales de la presente invención provienen de un equipamiento diagnóstico de laboratorio que evalúa la detección y la enumeración de células en muestras biológicas, junto con sistemas de microscopio para observar la microestructura de una célula bajo una amplificación deseada.

La tecnología de microscopía que emplea fases activadas por motor paso a paso para formar imágenes de áreas más grandes que el campo de visión del microscopio, tiene una utilidad clínica limitada. Por ejemplo, la velocidad alcanzable de adquisición de imágenes en análisis de citometría de imagen y el espacio de la mesa de laboratorio requerida para el Sistema Cell Spotter® limitan su uso clínico práctico. Actualmente, la adquisición de imágenes se realiza moviendo una corredera o un cartucho de muestra a través del campo de visión en un movimiento bustrofedónico paso a paso. Un movimiento bustrofedónico es un movimiento en el que dos líneas consecutivas a lo largo del eje más rápido son exploradas en sentidos opuestos. Se toma una imagen por cada paso. Cuando se obtienen múltiples imágenes fluorescentes de la misma muestra, el cubo de filtro se cambia y el movimiento bustrofedónico se repite tras la terminación de cada paso. Este proceso se repite hasta que se adquiere una imagen para todas las posiciones y todos los colores, completando una exploración de color por color. Tanto el movimiento del cubo de filtro como de la muestra se realizan mediante etapas de motor paso a paso con servo

retroalimentación, que limita considerablemente la velocidad de adquisición. El movimiento de un cubo de filtro hasta el siguiente necesita aproximadamente 2 segundos con 0, 5 segundos adicionales para el paso entre dos posiciones consecutivas. De ese modo, el tiempo total de adquisición consiste en el tiempo total de movimiento más el tiempo total de adquisición de imagen, haciendo de la adquisición el tiempo predominante gastado en movimiento en sistemas de formación de imagen como Cellspotter®.

Puesto que la técnica anterior emplea tecnología de motor paso a paso para conducir etapas de microscopio que se limitan a una frecuencia de actuación máxima en los motores paso a paso, existe una necesidad de desarrollar nuevos dispositivos que mejoren el tiempo de adquisición de imagen en un área grande. Además, mover la muestra (o el cartucho) puede provocar que las células se muevan con la inercia del fluido. Cualquier movimiento de una célula podría causar que el software de adquisición malinterprete las imágenes y cuente una célula como dos con una identificación impredecible.

Otro problema relacionado con la técnica anterior consiste en que durante el movimiento de etapa, la muestra está siendo continuamente iluminada. En consecuencia, los tintes fluorescentes utilizados en el etiquetado estarán sometidos a blanqueo. La ficoeritrina (PE) es un tinte utilizado normalmente en el etiquetado de células, pero es muy sensible al blanqueo. La reducción del tiempo invertido en el movimiento reducirá la cantidad de blanqueo de la muestra.

El equipo abarcado en la tecnología CellSpotter® incluye una cámara de muestra (documentos US 10/074.900, US 10/303.309 y US 5.993.665) que está situada en un dispositivo magnético (documento US 5.985.153) que dirige células etiquetadas magnéticamente en la muestra a una superficie planar ópticamente clara de la cámara. El dispositivo magnético y la cámara son colocados a continuación en un microscopio de fluorescencia equipado con un selector de filtro controlado por ordenador y en una etapa X-Y-Z controlada digitalmente.

La presente invención es una mejora del sistema de diagnóstico automatizado CellSpotter® para proporcionar análisis de muestra rápido utilizando múltiples indicadores fluorescentes. El dispositivo de formación de imágenes se ha mejorado además condensando los componentes según una configuración de caja simple para su colocación ventajosa en la mayoría de las mesas de laboratorio clínico. Esto proporciona una configura práctica en un laboratorio automatizado que carezca de una cantidad sustancial de espacio.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un sistema automatizado de obtención de imágenes para laboratorio clínico, para la detección de células raras conforme a la reivindicación 1, y un método para la adquisición de múltiples imágenes a partir de un cartucho de muestra según la reivindicación 5 o la reivindicación 6. El dispositivo de la presente invención es una unidad compacta y auto-contenida, diseñada para acoplarse encima de una mesa de laboratorio... [Seguir leyendo]

1. Un sistema automatizado de obtención de imágenes para laboratorio clínico para detectar células raras a partir de una muestra biológica, que comprende:

a. un sistema de iluminación que comprende una cámara CCD, un conjunto de óptica de iluminación, objetivo, cubos de filtro, lámpara con alojamiento, y un conjunto de obturador/filtro ND;

b. un conjunto de etapa X-Y-Z movido por medio de un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capacitados para proporcionar una resolución de 0, 2 micrones y que tienen una plataforma para posicionar un dispositivo magnético y un cartucho de muestra para la obtención de imágenes;

c. un sistema de detección fluorescente que tiene una pluralidad de cubos de filtro movidos por medio de un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capacitados para proporcionar una resolución de 0, 2 micrones, y

d. un ordenador con periféricos relacionados en el que a, b, c y d del sistema forman una estructura compacta y autocontenida.

2. El sistema de iluminación de la reivindicación 1, en el que dicha lámpara está prealineada.

3. El sistema de iluminación de la reivindicación 1, con capacidad para producir longitudes de onda de excitación de fluorescencia de entre 350 y 1000 nanómetros.

4. El sistema de iluminación de la reivindicación 1, en el que dicho sistema de detección contiene una estructura de iluminación de fondo para alineamiento de dicho cartucho de muestra.

5. Un método para adquirir múltiples imágenes a partir de un cartucho de muestra mediante una alternativa de color por color, que comprende:

a. disponer el sistema en posición de imagen;

b. mover el cartucho de muestra en la dirección x-y correspondiente a dicha posición, con un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capaces de proporcionar una resolución de 0, 2 micrones;

c. posicionar un cubo de filtro con un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capaces de proporcionar una resolución de 0, 2 micrones;

d. adquirir dicha imagen;

e. transferir dicha imagen, y

f. repetir los elementos c a e para una posición x-y en la que dicha repetición se realiza para cubo de filtro.

6. Un método para adquirir múltiples imágenes a partir de un cartucho de muestra mediante una alternativa de posición por posición, que comprende:

a. posicionar un primer cubo de filtro con un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capaces de proporcionar una resolución de 0, 2 micrones;

b. disponer el sistema en una posición de imagen;

c. mover el cartucho de muestra en la dirección x-y correspondiente a dicha posición, con un controlador de movimiento, un motor piezoeléctrico y codificadores de posición capacitados para proporcionar una resolución de 0, 2 micrones;

d. adquirir dicha imagen;

e. transferir dicha imagen;

f. repetir los elementos b a e para cada posición x-y, y

g. posicionar otro cubo de filtro para completar los elementos b a f, en el que dichos elementos se repiten para cada cubo.