CONSTRUCTOS MEJORADOS PARA EXPRESAR POLIPÉPTIDOS LISOSOMALES.

Constructos mejorados para expresar polipéptidos lisosomales Campo de la Invención La presente descripción se refiere a constructos de ácido nucleico novedosos que codifican polipéptidos lisosomales, en particular -glucosidasa ácida lisosomal, así como métodos de uso de los mismos para producir polipéptidos lisosomales recombinantes y para tratar déficits de los polipéptidos lisosomales. Antecedentes de la Invención La enfermedad de almacenamiento de glicógeno de tipo II (GSD II) es un trastorno clásico de almacenamiento lisosomal, caracterizado por la acumulación lisosomal de glicógeno y lesión tisular, principalmente en el músculo y el corazón (Hirschhorn, R. y Reuser, A.J. (2001) en The Metabolic and Molecular Basis for inherited Disease (Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S. & Valle, D. Eds.), págs. 3389-3419. McGraw-Hill, Nueva York). El déficit de enzima subyacente es de -glucosidasa ácida (GAA). En la cardiomiopatía progresiva y la miopatía asociadas a GSD II infantil grave conduce a insuficiencia cardiorrespiratoria y muerte a la edad de 1 año. En la GSD II de comienzo juvenil y adulto, más suave, la debilidad progresiva y la insuficiencia respiratoria son incapacitantes y se produce la muerte por insuficiencia respiratoria. Los modelos animales para el déficit de -glucosidasa ácida lisosomal humana (hGAA) imitan con exactitud la GSD II, y en esto sistemas se puede evaluar la eficacia de los enfoques para la terapia génica para la GSD II. El modelo de ratón con el gen GAA desactivado (GAA-KO) acumuló glicógeno en el músculo esquelético y cardíaco, y desarrolló debilidad y reducción de la movilidad (Raben, N., et al. (1988) J. Biol. Chem. 273:19086-19092, Bjvoet, A.G. et al., (1998) Hum. Mol. Genet. 7:53-62). La administración de GAA recombinante a un ratón GAA-KO demostró absorción de GAA por el músculo esquelético, presumiblemente a través de la absorción mediada por el receptor y liberación de GAA en los lisosomas (Bjvoet, A.G. et al. (1998) Hum. Mol. Genet. 7:1815-1824). El modelo de codorniz Japonesa es similar para la GSD II de comienzo juvenil, y ha sido tratada con éxito con sustitución con enzima recombinante (Kikuchi, T., et al. (1998) J. Clin. Invest. 101:827-833). La terapia con enzima ha demostrado ser eficaz para la GSD II infantil, grave; sin embargo la ventaja de la terapia enzimática está limitada por la necesidad de frecuentes infusiones y el desarrollo de anticuerpos inhibidores contra la hGAA recombinante (Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138). Como alternativa o complemento para la terapia génica, se ha investigado la viabilidad de los enfoques de terapia génica para tratar la GSD-II (Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866, Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446, Fraites, T.J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578, Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene. Ther. 9:1609-1616). La administración de un vector de adenovirus (Ad) que codifica hGAA que estaba dirigido a hígado de ratón en el modelo de ratón GAA-KO revirtió la acumulación de glicógeno en músculo esquelético y cardíaco en 12 días por medio de la secreción de hGAA desde el hígado y la absorción de otros tejidos (Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866). Los anticuerpos contra hGAA acortaron la duración de la secreción de hGAA con un vector de Ad en el hígado, aunque el ADN del vector y la hGAA permanecieron en los tejidos a niveles reducidos durante muchas semanas (Ding. E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446). La introducción de vectores de virus adenoasociado 2 (AAV2) que codificaban GAA normalizó la actividad de GAA en el músculo esquelético en el que se había inyectado y el músculo cardíaco en el que se había inyectado, y el contenido de glicógeno se normalizó en el músculo cuando se administró el vector de pseudotipo AAV1 con una mejoría de la transducción en el músculo (Fraites, T.J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578). Se intentó la terapia génica con vector de Ad dirigido al músculo en el modelo de codorniz Japonesa, aunque solamente se logró una reversión localizada de acumulación de glicógeno en el sitio de la inyección del vector (Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene. Ther. 9:1609-1616). La terapia génica neonatal puede tener una mayor eficacia que la administración más adelante en la vida, como evidenciaron los experimentos con numerosos modelos de enfermedad de roedores. Un vector de AAV administrado intravenosamente el segundo día de vida en ratones con déficit de ß-glucuronidasa (enfermedad de Sly) produjo niveles terapéuticamente relevantes de ß-glucuronidasa y corrigió el almacenamiento lisosomal en múltiples tejidos, incluyendo hígado y riñón (Daly, T.M., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2296-2300). De un modo similar, la inyección intramuscular del vector de AAV produjo niveles terapéuticos, sostenidos de expresión de ß-glucuronidasa y eliminó el almacenamiento lisosomal en músculo e hígado (Daly, T.M., et al. (1991) Hum. Gene Ther. 10:85-94). El ADN del vector de AAV permaneció en el músculo y en las zonas transducidas del hígado después de la inyección intramuscular neonatal en ratones con enfermedad de Sly (Daly, T.M., et al. (1999) Hum. Gene Ther. 10:85-94). El número de partículas de vector de AAV administrado a ratones Sly neonatos fue aproximadamente 100 veces menor que el necesario para producir niveles terapéuticamente relevantes de proteína en ratones adultos (Kessler, P.D., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14082-14087, Herzog, R.W., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5804-5809, Nakai, H., et al. (1998) Blood 91:4600-4607, Snyder, R.O., et al. (1997) Nat. Genet. 16:270-276, Koeberl, D.D., et al. (1999) Hum. Gene Ther. 10:2133-2140, Snyder, R.O., et al. (1999) Nat. Med. 5:64-70, Herzog, R.W. et al. (1999) Nat. Med. 5:56-63). Existe la necesidad en la técnica de métodos mejorados de producción de polipéptidos lisosomales tales como GAA 2   in vitro e in vivo, por ejemplo, para tratar los déficits de polipéptidos lisosomales. Además, existe la necesidad de métodos que den como resultado la liberación generalizada de GAA y otros polipéptidos lisosomales en tejidos y órganos afectados. Compendio de la Invención La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de constructos de ácido nucleico mejorados para expresar polipéptidos lisosomales tales como GAA. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal secretora de 1antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 conectada operablemente a un polipéptido de -glucosidasa ácida lisosomal (GAA) donde dicha secuencia señal secretora sustituye los primeros 27 aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo. Preferiblemente, el ácido nucleico está conectado operativamente a un elemento de control transcripcional operable en células de hígado. Preferiblemente, se proporciona una célula que comprende el vector de la invención o una formulación farmacéutica que comprende el vector de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal secretora de 1-antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 conectada operablemente a un polipéptido de GAA lisosomal, donde dicha secuencia señal secretora sustituye los primeros 27 aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un método in vitro de liberación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GAA lisosomal en una célula, que comprende poner en contacto una célula in vitro con el vector como se ha descrito antes en la presente memoria en condiciones suficientes para que el vector sea introducido en la célula y para que el ácido nucleico sea expresado para producir el polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal secretora de 1-antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 conectada operablemente al polipéptido de GAA lisosomal donde dicha secuencia señal secretora sustituye los 27 primeros aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un método para producir un polipéptido de -glucosidasa lisosomal (GAA) en una célula cultivada, que comprende: poner en contacto una célula cultivada con un vector como se ha descrito antes en la presente memoria en condiciones suficientes para que el vector sea introducido en la célula cultivada y para que el ácido nucleico sea expresado para producir el polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal secretora de la 1-antitripsina... [Seguir leyendo]

1. Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal secretora de 1-antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 unida operablemente a un polipéptido de -glucosidasa ácida lisosomal (GAA) donde dicha secuencia señal secretora sustituye los primeros 27 aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo. 2. El vector de la Reivindicación 1, donde dicho ácido nucleico está unido operablemente a un elemento de control de la transcripción operable en células del hígado. 3. Una formulación farmacéutica que comprende el vector de cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2 en un portador farmacéuticamente aceptable. 4. Una célula que comprende el vector de cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2. 5. Un polipéptido quimérico que comprende una secuencia señal secretora de la 1-antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 unida operablemente a un polipéptido de GAA lisosomal, donde dicha secuencia señal secretora sustituye los primeros 27 aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo. 6. Un método de liberación in-vitro de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GAA lisosomal en una célula, que comprende poner en contacto una célula in-vitro con un vector de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2 en condiciones suficientes para que el vector sea introducido en la célula y para que el ácido nucleico sea expresado para producir el polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal secretora de la 1antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 unida operablemente al polipéptido de GAA lisosomal donde dicha secuencia señal secretora sustituye los primeros 27 aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo. 7. Un método de producción de un polipéptido de -glucosidasa lisosomal (GAA) en una célula cultivada, que comprende: poner en contacto una célula cultivada con un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en condiciones suficientes para que el vector sea introducido en la célula cultivada y para que el ácido nucleico sea expresado para producir el polipéptido quimérico que comprende la secuencia señal secretora de la 1-antitripsina representada por el SEQ ID NO: 8 unida operablemente al polipéptido de GAA donde dicha secuencia señal secretora sustituye los primeros 27 aminoácidos del SEQ ID NO: 2 del polipéptido de GAA lisosomal nativo y el polipéptido de GAA es secretado desde la célula de cultivo, y recoger el polipéptido de GAA secretado al medio de cultivo celular. 8. Un vector de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 3 o una célula de acuerdo con la Reivindicación 4, para su uso en el tratamiento del déficit de un polipéptido de GAA lisosomal en un sujeto que padece la Enfermedad de Pompe. 9. El uso de un vector de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2 o una célula de acuerdo con la Reivindicación 4, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un déficit de un polipéptido de GAA lisosomal en un sujeto que padece la Enfermedad de Pompe. 10. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 8 o 9, donde el vector es liberado en el hígado. 51   52   53   54     56   57   58   Figura 8 Secuencia del ADNc de GAA humana completa (3846 pb, Número Genebank: NM_000152). 59   Figura 8 (página 2 de 2)   GAA con 5' y 3' suprimidos Figura 9 61   Figura 9 (página 2 de 2) 62   63   64     66   67   68   69     71