Una proteína de cadena única no natural que comprende:

(I) un primer polipéptido que tiene un polipéptido dominio de unión capaz de unirse a CD20,

dicho polipéptido dominio de unión comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una sustitución o deleción de aminoácido en uno o más residuos de aminoácidos;

(II) un segundo polipéptido que comprende una región conectora unida al primer polipéptido, en donde la región conectora comprende una región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada, en donde la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada comprende tres residuos de cisteína y un residuo de prolina, en donde uno o más de dichos residuos de cisteína esta sustituido y dicho residuo de prolina está sustituido; y

(III) un tercer polipéptido unido al segundo polipéptido que comprende un polipéptido de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina N-terminalmente truncado, en donde la proteína comprende la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 372 (2H7 scFv VHL11S (CSS-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 246 (2H7 scFv VH L11S (CSC-S)H WCH2 WCH3), SEQ ID No. 268 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H K322S CH2 WCH3), SEQ ID No. 276 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H P331S CH2 WCH3) o una secuencia polipeptídica que es al menos el 95% idéntica en toda su longitud a cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 372, 246, 268 y 276.

Construcciones de unión y métodos para el uso de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a compuestos que tienen varias utilidades incluyendo usos para investigación, diagnóstico y terapia, por ejemplo, inmunoterapia. Los compuestos de la invención incluyen proteínas y conjugados de proteínas inmunológicamente activos. Tales proteínas incluyen proteínas de unión recombinantes o manipuladas tales como, por ejemplo, proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulinas, que pueden incluir proteínas de fusión Fv de cadena única-inmunoglobulina y compuestos que contienen Fv de cadena únicainmunoglobulina. La presente invención también se refiere a composiciones y a su uso en métodos para tratar afecciones, enfermedades y trastornos que mejorarían, se aliviarían o reducirían a partir de la administración de, por ejemplo, construcciones de polipéptidos y/o ácidos nucleicos de la invención, incluyendo, por ejemplo, patologías malignas y trastornos de células B, incluyendo enfermedades caracterizadas por la producción de autoanticuerpos y/o inflamación.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune es uno de los más complejos de los muchos sistemas complejos del cuerpo. Una organización vasta y complicada hecha de muchos tipos diferentes de células y que implica muchos tipos diferentes de moléculas, el sistema inmune humano permite que el cuerpo responda a invasores exógenos tales como bacterias, virus y otros agentes infecciosos, así como a material exógeno tal como polen. En general, el sistema inmune humano se divide en dos partes principales, la inmunidad mediada por anticuerpos (también llamada inmunidad “humoral” o “circulante”) y la inmunidad celular, ambas están dirigidas por linfocitos. Los linfocitos son uno de los cinco tipos de glóbulos blancos (leucocitos) que circulan en la sangre. Hay varios tipos de linfocitos, cada uno con diferentes funciones que realizar. Los tipos más comunes de linfocitos son linfocitos B (células B) , que son responsables de hacer anticuerpos, y los linfocitos T (células T) . Las células del sistema inmune no solo incluyen células T y células B, sino también células citolíticas naturales, granulocitos (o leucocitos polimorfonucleares (PMN) ) , macrófagos y células dendríticas. El sistema humoral está dirigido por células B con ayuda de células T y se ocupa de agentes infecciosos en la sangre y tejidos del cuerpo. El sistema celular está dirigido por células T y se ocupa de células del cuerpo que han sido infectadas.

El complejo del sistema inmune está constituido por una variedad de diferentes tipos celulares y de órganos diseminados por todo el cuerpo. Estos incluyen los órganos linfoides primarios y secundarios. Los órganos linfoides primarios son la médula ósea y el timo. Todas las células del sistema inmune derivan inicialmente de la médula ósea en un proceso llamado hematopoyesis. Durante la hematopoyesis las células madre derivadas de la médula ósea se diferencian bien en células maduras del sistema inmune (células “B”) bien en precursores de células que migran fuera de la médula ósea para madurar en el timo (células “T”) . Además de los glóbulos rojos, plaquetas y células B, la médula ósea también produce células citolíticas naturales, granulocitos y timocitos inmaduros. La función del timo es producir células T maduras. Los timocitos inmaduros, también conocidos como protimocitos, dejan la médula ósea y migran al timo donde maduran y se liberan después al torrente sanguíneo. El complejo del sistema inmune también incluye órganos linfoides secundarios, por ejemplo, el bazo, los ganglios linfáticos, etc., así como un sistema circulatorio que está separado de los vasos sanguíneos.

La función principal de las células B es la producción de anticuerpos en respuesta a proteínas exógenas de bacterias, virus y células tumorales. Las células T habitualmente se dividen en dos grupos principales, es decir, los linfocitos T citotóxicos (células “Tc” o LTC) y las células T auxiliares (células “Th” o células T auxiliares) . Las células Th, también denominadas células T CD4+, funcionan para aumentar o potenciar las respuestas inmunes mediante la secreción de factores especializados que activan otros glóbulos blancos para rechazar la infección. Aumentan la producción de anticuerpos por las células B. Las células Tc, también llamadas células T CD8+, pueden aniquilar directamente ciertas células tumorales, células infectadas por virus y algunas veces parásitos. Las células Tc también son importantes en la disminución de las respuestas inmunes. Ambos tipos de células T con frecuencia dependen de los órganos linfoides secundarios (los ganglios linfáticos y el bazo) como sitios donde se produce la activación, pero también se encuentran en otros tejidos del cuerpo, incluyendo el hígado, pulmón, sangre y aparatos digestivo y reproductor.

Las células citolíticas naturales, con frecuencia denominadas células NK, representan otro tipo de linfocitos y son similares al subconjunto de células Tc. Funcionan como células efectoras que aniquilan directamente ciertos tumores tal como melanomas y linfomas, y células infectadas por virus. Se llaman citolíticas “naturales” porque, de forma diferente a las células T citotóxicas, no necesitan reconocer un antígeno específico antes de llevar a cabo su función. Mientras que las células NK, de forma diferente a las células Tc, aniquilan sus dianas sin activación anterior en los órganos linfoides, las células NK activadas por las secreciones de células Th aniquilarán dianas tumorales o infectadas con virus más eficazmente. Las células NK se dirigen a células tumorales y protegen contra una amplia variedad de microbios infecciosos. En varias enfermedades inmunodeficientes, incluyendo SIDA, la función de las células citolíticas naturales es anormal. Las células citolíticas naturales también pueden contribuir a la inmunorregulación mediante la secreción de niveles altos de linfoquinas influyentes.

Algunas células NK tienen receptores de superficie (FcyRIII, también llamado CD16) para la parte Fc del anticuerpo IgG. Se unen a las células diana a través de receptores para la parte Fc de un anticuerpo que ha reaccionado con un antígeno en una célula diana. Este tipo de inmunidad celular se llama citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) . Las células NK también pueden tener receptores para el componente C3 del complemento, otro sistema de defensa inmune, y por tanto, reconoce células que están recubiertas con C3 como dianas. Se piensa que la ADCC es una importante defensa contra una variedad de infecciones parasíticas producidas, por ejemplo, por protozoos y helmintos.

Aunque los linfocitos pequeños parecen idénticos, se pueden distinguir por las moléculas que tienen en la superficie celular. Tales marcadores no solo distinguen entre células B y células T, distinguen entre varios subconjuntos de células que se comportan de forma diferente. Cada célula T madura, por ejemplo, tiene un marcador conocido como T3 (o CD3) . Además, la mayoría de las células T auxiliares tienen un marcador T4 (CD4) , una molécula que reconoce antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (“MHC”) de clase II. Una molécula conocida como T8 (CD8) , que reconoce antígenos de MHC de clase I, se encuentra en muchas células T supresoras/citotóxicas.

Las actividades biológicas de las respuestas inmunes mediadas por anticuerpos y celulares son diferentes y varían de un tipo de infección a otro. Hay varias clases o tipos de anticuerpos (y subclases de varios tipos) implicados en la inmunidad mediada por anticuerpos. Todas las clases de anticuerpos que se producen en respuesta a un antígeno específico reaccionan estereoquímicamente con ese antígeno y no con otros antígenos (diferentes) . El huésped tiene la capacidad genética para producir anticuerpos específicos para miles de antígenos diferentes, pero no lo hace hasta que hay un estímulo antigénico (específico) apropiado. Debido a la selección clonal, el huésped produce solo los anticuerpos homólogos que reaccionarán con ese antígeno que, como se ha indicado anteriormente, se encuentran en la sangre (plasma) , linfa y muchos tejidos extravasculares. Una vez que se produce la respuesta de inmunidad mediada por anticuerpos, después de la interacción de los linfocitos B con el antígeno y su diferenciación a células plasmáticas secretoras de anticuerpos, el anticuerpo secretado se une al antígeno... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de cadena única no natural que comprende:

(I) un primer polipéptido que tiene un polipéptido dominio de unión capaz de unirse a CD20, dicho polipéptido dominio de unión comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una sustitución o deleción de aminoácido en uno o más residuos de aminoácidos;

(II) un segundo polipéptido que comprende una región conectora unida al primer polipéptido, en donde la región conectora comprende una región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada, en donde la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana alterada comprende tres residuos de cisteína y un residuo de prolina, en donde uno o más de dichos residuos de cisteína esta sustituido y dicho residuo de prolina está sustituido; y

(III) un tercer polipéptido unido al segundo polipéptido que comprende un polipéptido de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina N-terminalmente truncado, en donde la proteína comprende la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 372 (2H7 scFv VHL11S (CSS-S) H WCH2 WCH3) , SEQ ID No. 246 (2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3) , SEQ ID No. 268 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3) , SEQ ID No. 276 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3) o una secuencia polipeptídica que es al menos el 95% idéntica en toda su longitud a cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 372, 246, 268 y 276.

2 .Un polinucleótido que codifica una proteína de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No. 371 (2H7 scFv VHL11S (CSS-S) H WCH2 WCH3) , SEQ ID No. 245 (2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3) , SEQ ID No. 267 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3) , SEQ ID No. 275 (2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3) o una secuencia que es al menos el 95% idéntica en toda su longitud a cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 371, 245, 267 y 275.

3 .Una célula huésped recombinante que incluye un polinucleótido de la reivindicación 2.

4 .Un vector recombinante que expresa una proteína de la reivindicación 1.

5. Una composición que comprende una proteína de la reivindicación 1 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

6. La proteína de la reivindicación 1 o composición de la reivindicación 5 para su uso en terapia.

Figura 12: Análisis por SDS-PAGE de derivados de CitoxB. Se resuspendieron proteínas de fusión derivadas de moléculas CitoxB-scFvIg y Rituximab en tampón de muestra de SDS, se hirvieron, se cargaron en geles Tris-Bis Novex al 10% (Invitrogen, San Diego, CA) y se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE no recdutora (panel izquierdo) o reductora (panel derecho) a 175 voltios. También se cargaron en cada gel dos marcadores de peso molecular diferente, marcadores preteñidos de BioRad y marcadores de peso molecular Novex Multimark, y se indica el tamaño aproximado en kDa de cada banda de marcador en cada lado de los geles fotografiados. Los geles se tiñeron con teñidor de azul de Coomassie y se fotografiaron con una cámara digital Mavica de SONY. Las formas con bisagra mutada de 2H7 scFvIgG1 migran a aproximadamente 70 kDa tanto en condiciones no reductoras como reductoras, lo que indica que estas moléculas son de estructura monomérica más que dimérica. La forma con bisagra de IgA de 2H7 scFvIg migra a aproximadamente 75 kDa en condiciones reductoras, pero migra predominantemente como un dímero de 140 kDa con una fracción de la proteína que migra a 75 kDa en condiciones no reductoras. En condiciones no reductoras, rituximab migra como una banda difusa de entre 150 y 200 kDa. Las cadenas pesada y ligera se resulven en bandas separadas de aproximadamente 32 y 50 kDa cuando rituximab se reduce y se somete a SDS-PAGE.

Figura 13: Actividad ADCC de derivados de CitoxB comparados con Rituximab. Se midió la actividad ADCC de derivados de CitoxB o Rituximab in vitro con la línea de células de linfoma B BJAB como diana y usando PBMC humanas recientes ocmo células efectoras. Las relaciones de efector a diana variaron como sigue: 70:1, 35:1 y 18:1, permaneciendo constante el número de células BJAB por pocillo pero variando el número de PBMC. Las células Bjab se marcaron durante 2 horas con 51Cr y se alicuotearon a una densidad de 5x104 células/pocillo en cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron las proteínas de fusión purificadas o rituximab a una concentración de 10 mg/ml, y se añadieron PBMC a 9x105 células/pocillo (18:1) , 1, 8x106 células/pocillo (35:1) o 3, 6x106 células/pocillo (70:1) , en un volumen final de 200 μl. La liberación espontánea se midió sin adición de PBMC o proteína de fusión, y la liberación máxima se midió mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 4 horas, y se recogieron 100 ml de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejó secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Top Count NTX de Packard.

Figura 14. Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de derivados de CitoxB comparados con Rituximab. Se comparó la capacidad de los derivados 2H7 scFvIgG1 (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFvIgG1 (SSS-S) H WCH2 WCH3 y 2H7 scFv IgA WH IgG1 WCH2 WCH3 y Rituximab para mediar citotoxicidad dependiente del complemento. Se diluyó complemento de conejo (Pel-Freez) 1:10 y se añadió a células BJAB junto con diluciones de cada derivado de anticuerpo (20 μg/ml, 10 μg/ml y 5 μg/ml) . También se incluyeron controles sin adición de complemento (C') o derivado de scFv. Las reacciones se dejaron continuar durante 1 hora, y las células de cada pocillo se tiñeron después con azul de tripán y se contó la viabilidad celular usando un hemocitómetro. Los datos se representan como % de células muertas/células totales contadas para cada condición ensayada.

Fig. 29 Construcciones de Ig y nomenclatura

50:1 y 25:1, permaneciendo constante el número de células BJAB por pocillo pero variando el número de PBMC. Las células Bjab se marcaron durante 2 horas con 51Cr y se alicuotearon a una densidad de 5x104 células/pocillo en cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadieron las proteínas de fusión purificadas o rituximab a una concentración de 10 μg/ml, y se añadieron PBMC a 1, 25x106 células/pocillo (25:1) , 2, 5x106 células/pocillo (50:1) o 5x106 células/pocillo (100:1) , en un volumen final de 200 μl. La aniquilación natural se midió a cada relación efector:diana mediante la omisión de SMIP de Acm-La liberación espontánea se midió sin adición de PBMC o proteína de fusión, y la liberación máxima se midió mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 5 horas, y se recogieron 100 μl de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejó secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Top Count NTX de Packard.

Figura 79: Los SMIP de CitoxB20G se unen similarmente a células U937 que expresan el FCR de alta afinidad (FcyRI, C064) . Se incubaron células U937 que expresaban CD64 en PBS/SBF al 2% durante una hora en hielo con CitoxB20G o CitoxB20G P238S. Las células se lavaron y se incubaron durante una hora en hielo con anti-IgG1 humana de cabra-FITC (específico para Fc) (Caltag) a una dilución final de 1:100. Las células se lavaron y se analizó la fluorescencia en un citómetro de flujo EpicsC de Beckman-Coulter. Los datos se analizaron usando el software de análisis Expo, y la intensidad de fluorescencia se representó como función de la concentración de SMIP.

Figura 80: Se administraron CitoxB20G o CitoxB20G P238S a macacos por inyección intravenosa a 6 mg/kg, con infusiones dadas con una semana de diferencia. Se midió el efecto sobre las células B circulantes mediante la detección de células B CD40 positivas en sangre periférica. Se sacaron muestras de sangre de los animales inyectados los días -7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 y 43. La eliminación de células B se estimó realizando hemogramas completos y análisis de citometría de flujo de dos colores en sangre de mono. Se usaron conjugados a FITC o PE de anticuerpos contra CD40, CD19, CD20, IgG, CD3 y CD8 en varias combinaciones. Los datos se representan como el número de células B en sangre CD40 positivas tabuladas en miles de células por microlitro durante el tiempo relativo al nivel de células B del tiempo preinyección (máximo) .

Figura 87: Se incubaron SMIP de CD37 a 10 μg/ml en placas de 96 pocillos de fondo plano con 104 células Ramos marcadas con 51Cr y PBMC humanas en reposo a diferentes relaciones efector:diana que variaban de 0 a 100. Todas las incubaciones se realizaron en triplicado a cada relación efector:diana. Se midió la aniquilación natural a cada relación efector:diana mediante omisión de SMIP. Se midió la liberación espontánea sin adición de PBMC o proteína de fusión, y se midió la liberación máxima mediante la adición de detergente (NP-40 al 1%) a los pocillos apropiados. Las reacciones se incubaron durante 6 horas, y se recogieron 100 ml de sobrenadante de cultivo a un Lumaplate (Packard Instruments) y se dejaron secar durante la noche antes de contar las cpm liberadas en un contador de centelleo de microplacas Top Count NXT de Packard.