Un promotor híbrido que comprende la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 28.

Construcciones de ADN para expresión de polipéptidos heterólogos en plantas

Campo de la invención

La presente invención se refiere al aislamiento y uso de moléculas de ácido nucleico para control de expresión génica, específicamente nuevos promotores de plantas.

Antecedentes de la invención

Uno de los objetivos de la ingeniería genética de plantas es producir plantas con características o rasgos agronómicamente importantes. Recientes avances en la ingeniería genética han proporcionado las herramientas necesarias para producir plantas transgénicas que contengan y expresen genes ajenos (Kahl y col., World J. of Microbiol. Biotech. 11:449-460, 1995) . Los rasgos o cualidades particularmente deseables de interés para ingeniería genética de plantas incluirían pero sin limitación resistencia a insectos, enfermedades fúngicas y otras plagas y agentes que provocan enfermedades, tolerancias a herbicidas, tiempo de conservación o estabilidad potenciados, rendimiento, tolerancias ambientales y potenciaciones nutricionales. Los avances tecnológicos en transformación y regeneración de plantas han permitido a los investigadores tomar ADN exógeno, tal como un gen o genes de una fuente heteróloga o nativa, e incorporar el ADN exógeno en el genoma de la planta. En un enfoque, la expresión de un nuevo gen que no se expresa normalmente en una planta partícula o tejido vegetal puede conferir un efecto fenotípico deseado. En otro enfoque, la transcripción de un gen o parte de un gen en una orientación antisentido puede producir un efecto deseable evitando o inhibiendo la expresión de un gen endógeno.

Para producir una planta transgénica, una construcción que incluye una secuencia de gen heterólogo que confiere un fenotipo deseado cuando se expresa en la planta se introduce en una célula vegetal. La construcción también incluye un promotor vegetal que se une operativamente a la secuencia del gen heterólogo, con frecuencia un promotor no asociado normalmente con el gen heterólogo. La construcción se introduce después en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada, y la célula vegetal transformada se regenera en una planta transgénica. El promotor controla la expresión de la secuencia de ADN introducida a la que se une operativamente el promotor y de este modo afecta a la característica deseada conferida por la secuencia de ADN.

Sería ventajoso tener varios promotores para adaptar la expresión génica de modo que se transcriba un gen o genes eficazmente en el momento correcto durante el crecimiento y desarrollo de la planta, en la localización óptima de la planta, y en la cantidad necesaria para producir el efecto deseado. Por ejemplo, la expresión constitutiva de un producto génico puede ser beneficiosa en una localización de la planta pero menos beneficiosa en otra planta de la planta. En otros casos, puede ser beneficioso tener un producto génico producido en un cierto estadio del desarrollo de la planta o en respuesta a ciertos estímulos ambientales o químicos. El desarrollo comercial de germoplasma mejorado genéticamente también ha avanzado al estadio de introducir múltiples rasgos en plantas de cultivo, con frecuencia denominado enfoque de apilamiento génico. En este enfoque, pueden introducirse múltiples genes que confieren diferentes características de interés a una planta. Es importante cuando se introducen múltiples genes en una planta que cada gen se module o controle para expresión óptima y que los elementos reguladores sean diversos para reducir el potencial de silenciamiento génico. A la luz de estas y otras consideraciones, resulta evidente que el control óptimo de la expresión génica y diversidad de elementos reguladores son importantes en la biotecnología de plantas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un promotor híbrido que comprende las secuencias expuestas en SEC ID Nº: 28. Dicho promotor híbrido es una secuencia promotora quimérica que comprende al menos un elemento potenciador cis de un promotor del Virus del Mosaico de la Escrofularia (FMV) unido operativamente con al menos un elemento cis de un promotor del factor de elongación de Arabidopsis a (EF1a) , consistiendo este último esencialmente en una región reguladora 5’ derivada de SEC ID Nº: 12.

La invención se refiere además a una construcción de ADN que comprende: uno o más casetes de expresión que comprenden una secuencia de ADN promotora híbrida como se ha definido anteriormente y una secuencia de ADN estructural unida operativamente con el promotor híbrido.

El gen estructural puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en la que la expresión de la secuencia dé como resultado un rasgo o producto agronómicamente útil en una planta de cultivo transgénica.

De acuerdo con otro aspecto de la invención hay una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN estructural unida operativamente con las secuencias promotoras de la presente invención que codifican una proteína empleada para conferir tolerancia a herbicidas a una planta de cultivo. Esta proteína de tolerancia a herbicidas incluye, pero sin limitación, genes de proteínas de tolerancia a glifosato tales como gen de EPSP sintasa resistente a glifosato solo, o en combinación con uno o más genes de proteína degradante de glifosato.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona una construcción de ADN tal como la descrita anteriormente en la que la secuencia de ADN estructural es un gen de tolerancia a glifosato, de modo que cuando la construcción de ADN se introduce en una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación de glifosato acuosa que incluye al menos 50 gramos de equivalente ácido por litro (g a.e/l) de glifosato. En otras realizaciones relacionadas, la construcción de ADN confiere a la célula vegetal tolerancia a formulaciones de glifosato que tienen concentraciones de glifosato más altas (por ejemplo, al menos 300 gramos de equivalente ácido por litro de glifosato) . De acuerdo con una realización, la construcción de ADN confiere a la célula vegetal tolerancia a al menos una aplicación de Roundup Ultra® a una tasa de 1, 12 kg/hectárea (16 onzas (oz) por acre) , por ejemplo, y en otras realizaciones, la tolerancia de glifosato se extiende a de una a dos o más aplicaciones de 1, 12 kg/hectárea (16 onzas (oz) por acre) , 2, 24 kg/hectárea (32 onzas (oz) por acre) o 4, 48 kg/hectárea (64 onzas (oz) por acre) , por ejemplo.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan plantas de cultivo transgénicas que se transforman con una construcción de ADN como se ha descrito anteriormente, incluyendo especies monocotiledóneas y especies dicotiledóneas. Los inventores han descubierto que los promotores de actina de Arabidopsis y EF1a de Arabidopsis son suficientemente activos en otras especies vegetales de cultivo tales como algodón, tomate y girasol, por ejemplo, que cuando se usan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato, tal como, aroA:CP4, las plantas toleran tasas de aplicación comerciales de glifosato, mostrando buena tolerancia vegetativa y bajo daño a tejidos reproductivos. Tales promotores también pueden usarse para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero sin limitación, genes que confieren tolerancia a herbicidas, combate de insectos, resistencia a enfermedad, estabilidad o tiempo de conservación aumentados, mayor rendimiento, potenciación nutricional, expresión de un agente farmacéutico u otro producto polipeptídico deseado, o un cambio deseable en la fisiología o la morfología de la planta, y así sucesivamente.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan plantas de cultivo transgénicas que se transforman con múltiples construcciones de ADN que comprenden los promotores de actina de Arabidopsis y EF1a de Arabidopsis que son suficientemente activos en otras especies vegetales tales como algodón, tomate, girasol, por ejemplo, que cuando se usan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato tal como aroA:CP4, las plantas toleraron las tasas de aplicación comerciales de glifosato, mostrando buena tolerancia vegetativa y bajo daño a tejidos reproductivos. Tales promotores pueden usarse también para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero sin limitación, genes que confieren tolerancia a herbicidas, combate de insectos, resistencia a enfermedad, estabilidad o tiempo de conservación aumentados, mayor rendimiento, potenciación... [Seguir leyendo]

1. Un promotor híbrido que comprende la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 28.

2. Una construcción de ADN que comprende: uno o más casetes de expresión que comprenden el promotor híbrido de la reivindicación 1 y una secuencia de ADN estructural unida operativamente al promotor híbrido.

3. La construcción de ADN de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de ADN estructural está además unida operativamente a una región 3’ no traducida.

4. La construcción de ADN de la reivindicación 2 ó 3, en la que la secuencia de ADN estructural es un gen de tolerancia a herbicida.

5. La construcción de ADN de la reivindicación 4, en la que el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato.

6. La construcción de ADN de la reivindicación 5, en la que el gen de tolerancia a glifosato es un gen de la 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) o un gen de glifosato oxidorreductasa (GOX) .

7. La construcción de ADN de la reivindicación 5, en la que el gen de tolerancia a glifosato es un gen aroA:CP4.

8. La construcción de ADN de la reivindicación 7, en la que el gen aroA:CP4 está además unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un péptido de transito de cloroplasto (CTP) , en el que dicho CTP es el CTP2 de Arabidopsis (CTP2-aroA:CP4) .

9. La construcción de ADN de la reivindicación 3, en la que la región 3’ no traducida comprende un terminador de la transcripción.

10. La construcción de ADN de la reivindicación 8 ó 9, en la que el CTP2-aroA:CP4 está además unido operativamente a la región de terminación 3’ E9 (CTP2-aroA:CP4-E9 3’) .

11. La construcción de ADN de la reivindicación 2, en la que el uno o más casetes de expresión comprenden un promotor híbrido de la reivindicación 1 unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica una EPSPS de aroA:CP4 como se muestra en la FIG. 11 ó 13, cuya secuencia ADN estructural está además unida operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un CTP2 y una región de terminación 3’ E9.

12. La construcción de ADN de la reivindicación 2 que comprende un primer y un segundo casete de expresión como se muestra en la Figura 7, en la que el primer casete de expresión comprende un promotor híbrido de la reivindicación 1 unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica una EPSPS de aroA:CP4, cuya secuencia de ADN estructural está además unida operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un CTP2 y la región de terminación 3’ E9, y el segundo casete de expresión comprende un promotor híbrido de CaMV:Act8 unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica una EPSPS de aroA:CP4, cuya secuencia de ADN estructural está además unida operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un CTP2 y la región de la terminación 3’ E9.

13. La construcción de ADN de la reivindicación 2, en la que la secuencia de ADN estructural es un gen de control de insectos de Bacillus thuringiensis.

14. Una célula de planta transgénica que comprende la construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.

15. Una planta transgénica que comprende la construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.

16. La planta transgénica de la reivindicación 15, caracterizada además por tener tolerancia vegetativa al glifosato y mostrar daño a glifosato bajo para el tejido reproductor.

17. La planta transgénica de la reivindicación 16, en la que la planta es capaz de tolerar la exposición a glifosato a una tasa de hasta 17, 93 kg/ha (256 oz/acre) .

18. La planta transgénica de la reivindicación 16, en la que la planta es capaz de tolerar la exposición a glifosato a una tasa que varía de 1, 12 a 4, 48 kg/ha (de 16 a 24 oz/acre) .

19. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que dicha planta transgénica es una especie de cultivo monocotiledónea.

20. La planta transgénica de la reivindicación 19, en el que dicho cultivo monocotiledóneo es cebada, maíz, arroz, sorgo o trigo.

21. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que dicha planta es una especie

de cultivo dicotiledóneo.

22. La planta transgénica de la reivindicación 21, en el que dicho cultivo dicotiledóneo es alfalfa, tomate, soja, algodón, canola o girasol.

23. La planta transgénica de la reivindicación 22, en la que dicho cultivo dicotiledóneo es algodón que comprende la construcción de ADN como se muestra en la FIG. 7, teniendo dicho algodón un valor de mapa de bola mayor que o igual a 3 después de una exposición a glifosato después de la etapa de 4 hojas, en el que el valor de mapa de bola se determina pulverizando el algodón después de la etapa de 4 hojas con glifosato a una tasa de 3, 36 kg/ha (48 oz/acre) , permitiendo que la planta de algodón se desarrolle hasta la madurez y determinando la cantidad de bolas de primera posición para las cinco primeras bolas.

24. Una semilla de la planta transgénica de la reivindicación 15, en la que dicha semilla comprende dicha construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.

25. Una semilla de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicha semilla es una semilla transgénica seleccionada del grupo que consiste en semillas de Arabidopsis thaliana, soja, canola, trigo, maíz, algodón y tomate.

26. Un producto útil desde el punto de vista agronómico procesado a partir de la plante transgénica de la reivindicación 15, en el que el producto comprende la construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.

27. Uso del promotor híbrido de la reivindicación 1 en la construcción de una planta transgénica, en la que dicha planta transgénica comprende dicho promotor híbrido.

28. Un procedimiento para producir una planta transgénica, que comprende regenerar la célula de la planta transgénica de la reivindicación 14 en una planta transgénica, en la que dicha planta transgénica comprende dicha construcción de ADN.

29. Un procedimiento para expresar una secuencia de ADN estructural en una planta, comprendiendo el procedimiento:

(1) proporcionar una construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13;

(2) introducir la construcción de ADN en una célula vegetal; y

(3) regenerar la célula vegetal para producir la planta de tal manera que la secuencia de ADN estructural pueda expresarse en la planta.

30. Un procedimiento para el control de malezas, comprendiendo el procedimiento:

(1) proporcionar una planta de cultivo transformada con una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12; y

(2) aplicar a la planta de cultivo una cantidad suficiente de glifosato para controlar las malezas sin dañar a la planta de cultivo.