Procedimiento de degradación de compuestos orgánicos recalcitrantes presentes en efluentes industriales mediante un sistema en dos etapas.

La primera etapa (etapa I) caracterizada por la utilización de la enzima manganeso peroxidasa (MnP) o peroxidasa versátil (VP), agentes quelantes, manganeso (II) y peróxido de hidrógeno en reactores agitados para la generación de especies oxidativas de manganeso (III). La salida del reactor enzimático (etapa I) se separa en dos corrientes utilizando una membrana de ultrafiltración. Una corriente contiene la/s enzima/s (MnP o VP y/o GOD) que es retornada al reactor enzimático (etapa I) mientras que la segunda corriente, que contiene las especies oxidativas de manganeso (III) se introduce en el reactor de degradación (etapa II) en donde se lleva a cabo la degradación de compuestos recalcitrantes, en reactores agitados. El manganeso es recuperado por un equipo de ósmosis inversa que lo retorna al reactor enzimático (etapa I).

Procedimiento de degradación de compuestos orgánicos recalcitrantes presentes en efluentes industriales mediante un sistema en dos etapas.

Sector de la técnica La presente invención se refiere a un procedimiento de degradación de compuestos orgánicos recalcitrantes presentes en efluentes industriales mediante un sistema en dos etapas. En un reactor enzimático (etapa I) se generan especies oxidativas de Mn3+ -quelato, como producto del ciclo catalítico de la enzima MnP o VP, que tras ser separadas de la enzima utilizando un sistema de ultrafiltración, son utilizadas, en un reactor de degradación (etapa II) , como agentes oxidantes de compuestos orgánicos recalcitrantes, tales como tintes industriales, compuestos farmacéutico y de cuidado personal, disruptores endocrinos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc.

Estado de la técnica

Los hongos de podredumbre blanca son microorganismos capaces de degradar la lignina. Esta capacidad viene asociada a la producción y secreción de un complejo enzimático extracelular. La capacidad de oxidar un polímero tan complejo como la lignina ha planteado la posible utilización de estos microorganismos para su aplicación en procesos de degradación de compuestos orgánicos recalcitrantes de alto peso molecular como son los polifenoles y poliaromáticos (Field J.A. et al., 1992; Appl Environ Microb 58:2219-2226) , decoloración de efluentes industriales (Banat I.M. et al., 1996; Bioresource Technology 58:217-227) y bioblanqueo de pasta de papel (Moreira M.T. et al., 1997; J Biotechnol 53:237-251) . Asimismo, se han publicado diversas patentes en las que se describe la posible utilidad de los hongos de podredumbre blanca en el tratamiento de tintes tipo azo (Paszczynski A. et al., 1997. US005618726A) , así como de sus peroxidasas extracelulares (Barfoed M. y Kirk O., 1996. US6036729; Rochefort D. et al., 1999. WO9954545; Feijoo G., et al., 2004. EP1457463A1) . Entre las enzimas extracelulares producidas se encuentran fundamentalmente dos familias: oxidasas como la Lacasa (Lac) y peroxidasas como la Manganeso Peroxidasa (MnP) , Lignina Peroxidasa (LiP) y Peroxidasa Versátil (VP) . La VP es capaz de oxidar Mn2+ aMn3+ y compuestos aromáticos no fenólicos.

El ciclo catalítico de las enzimas MnP y VP se inicia con la oxidación, mediante H2O2, de la enzima en su estado original para formar la especie oxidada MnPI/VPI, que es dos estados de oxidación superior a la forma nativa. Este compuesto es reducido por un ión de Mn2+, que se oxida a Mn3+, pasando a la forma MnPII/VPII, un estado de oxidación superior a la forma nativa de la enzima. Finalmente esta forma oxida otro ión de Mn2+ , para formar Mn3+, y vuelve a su forma nativa MnP/VP. Un exceso de concentración de H2O2 puede conducir a la formación de la especie inactiva de la enzima MnPIII/VPIII. Este ciclo catalítico se muestra en la figura 1.

La oxidación de Mn2+ genera Mn3+ que es una especie oxidativa fuerte (1, 54 V) y actúa como mediador en la degradación de compuestos orgánicos (Cui and Dolphin 1990; Holzforschung 44:279-283) . Esto supone que el compuesto diana no es oxidado directamente por la enzima sino que es oxidado por el ión Mn3+. Esta especie es inestable por lo que es necesaria la presencia de agentes quelantes (por ejemplo ácidos orgánicos dicarboxílicos de cadena abierta tales como ácido malónico, oxálico, glicólico, etc ...) que formen complejos con el Mn3+ , capaces de oxidar moléculas orgánicas (Martínez A.T., 2002; Enzyme Microb Tech 30:425:4441 Kishi K. et al., 1994; Biochemistr y 33:8694-8701| Kuan I.C. et al., 1993; P Natl Acad Sci USA 90:1242-1246) .

Las especies Mn3+ -quelato tienen muchas ventajas como agentes oxidantes comparadas con las enzimas, ya que al no ser proteínas, son más tolerantes a condiciones extremas como altas temperaturas, pH, agentes oxidantes, detergentes y proteasas. Además, debido a su pequeño tamaño molecular, pueden atravesar micro-barreras inaccesibles para las proteínas.

Uno de los mayores inconvenientes que tiene la utilización de enzimas para la biodegradación de compuestos recalcitrantes recae en el elevado consumo de enzima y su tendencia a la inactivación a lo largo del proceso. Un sistema más eficiente debería, por tanto, enfocarse en la reducción del consumo de enzima y en el aumento de su estabilidad. Este objetivo se puede conseguir a través de la separación del proceso en dos etapas; en una primera etapa, se activa el ciclo catalítico de la enzima MnP o VP para generar el complejo Mn3+-quelato y, en la segunda, se utiliza el complejo en la degradación de un compuesto recalcitrante. De este modo, la enzima se encuentra en las mejores condiciones posibles ya que siempre permanece en contacto con los cofactores de su ciclo catalítico a condiciones de pH y temperatura moderadas y en ausencia de los compuestos orgánicos recalcitrantes. Otros autores han propuesto la utilización de la enzima manganeso peroxidasa en dos etapas (Grabski et al., 1998; Botechnol Bioeng 60:20142151 Sasaki et al., 2001; Appl Envrion Microb 67:2208-2212) . Ambos propusieron un sistema en donde la enzima manganeso peroxidasa es inmovilizada sobre un soporte e introducida en una columna, de tal modo que la enzima es retenida en el interior de la columna mientras que el Mn3+-quelato es separado y utilizado en una segunda etapa para la degradación de clorofenoles o el bioblanqueo de la pasta de papel, respectivamente. Los procesos de inmovilización de enzimas, como los utilizados por Grabski y Sasaki, presentan muchos inconvenientes, tales como baja retención de la actividad enzimática, baja reproducibilidad, baja resistencia mecánica, etc. (Schoevaart R. et al., 2004; Biotechnol Bioeng 87:754-762) , además de que la utilización de soportes para inmovilizar las enzimas encarecen mucho el proceso ya que normalmente están hechos de materiales muy caros.

Por otra parte, el manganeso presenta un límite ambiental de 0, 05 mg L-1, por lo que su vertido en las aguas ha de ser controlado; los trabajos presentados por Grabski y Sasaki no describen ningún sistema de recuperación de manganeso.

Descripción de la invención La presente invención describe un procedimiento de degradación de compuestos orgánicos recalcitrantes presentes en efluentes industriales mediante un sistema en dos etapas.

La primera etapa (etapa I) se caracteriza por la utilización de la enzima manganeso peroxidasa (MnP) o peroxidasa versátil (VP) , agentes quelantes, manganeso (II) y peróxido de hidrógeno en reactores agitados (reactor enzimático) operados en continuo, semicontinuo o discontinuo para la generación de especies oxidativas de manganeso (III) .

La adición de peróxido de hidrógeno puede ser directamente u, opcionalmente, generada in situ por la enzima glucosa oxidasa (GOD) utilizando glucosa como sustrato, tal y como se indica en la ecuación 1.

Ecuación 1

Reacción de la enzima glucosa oxidasa con la glucosa La salida del reactor enzimático se separa en dos corrientes utilizando una membrana de ultrafiltración. Una corriente contiene la/s enzima/s (MnP o VP y/o GOD) que es retornada al reactor enzimático (etapa I) mientras que la segunda corriente, que contiene las especies oxidativas de manganeso (III) se introduce en el reactor de degradación (etapa II) .

La segunda etapa (etapa II) se caracteriza por llevar a cabo la degradación del compuesto recalcitrante, en reactores en continuo, semicontinuo o discontinuo, utilizando las especies oxidativas de manganeso (III) generadas en el reactor enzimático (etapa I) , y por la utilización de un equipo de ósmosis inversa para la recuperación de manganeso que es retornado al inicio del proceso.

El uso de la membrana de ultrafiltración permite el uso de las enzimas MnP, VP y GOD en forma libre en el reactor enzimático (etapa I) , es decir, no es necesaria su inmovilización. Esto supone una reducción elevada de los costes de operación tanto por la pérdida de actividad enzimática asociada al proceso de inmovilización, como por el alto coste de los soportes utilizados para la inmovilización.

El uso de un equipo de ósmosis inversa permite la casi total recuperación del manganeso utilizado, reduciéndose su consumo y evitando su vertido al ambiente. De este modo se reducen costes de operación asociados al consumo de manganeso (II) asegurando que los vertidos de este metal al ambiente están siempre por debajo del límite ambiental.

En la presente invención se plantea la utilización de la enzima MnP o VP en el reactor enzimático (etapa I) en...

1. Procedimiento de degradación de compuestos orgánicos recalcitrantes presentes en efluentes industriales que comprende un sistema en dos etapas:

- La primera etapa (etapa I) está caracterizada por la utilización de la enzima manganeso peroxidasa (MnP)

o peroxidasa versátil (VP) , agentes quelantes, manganeso (II) y peróxido de hidrógeno en reactores agitados (reactor enzimático) operados en continuo, semicontinuo o discontinuo para la generación de especies oxidativas de manganeso (III) , y una membrana de ultrafiltración, y

- La segunda etapa (etapa II) está caracterizada por llevarse a cabo la degradación de compuestos recalcitrantes, en reactores en continuo, semicontinuo o discontinuo, utilizando las especies oxidativas de manganeso (III) generadas en el reactor enzimático (etapa I) , y por la utilización de un equipo de ósmosis inversa para la recuperación de manganeso, que es retornado al reactor enzimático.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el peróxido de hidrógeno se adiciona directamente al reactor enzimático u, opcionalmente, el peróxido de hidrógeno es generado in situ añadiendo la enzima glucosa oxidasa (GOD) utilizando glucosa como sustrato.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el control de velocidad de adición del sustrato enzimático (H2O2 o glucosa) en base a la medición de oxígeno disuelto en el reactor enzimático (etapa I) .

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la separación de la salida del reactor enzimático (etapa I) en dos corrientes utilizando una membrana de ultrafiltración, donde una corriente contiene la/s enzima/s (MnP o VP y/o GOD) que es retornada al reactor enzimático (etapa I) mientras que la segunda corriente, que contiene las especies oxidativas de manganeso (III) se introduce en el reactor de degradación (etapa II) .

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por una velocidad de adición de la enzima manganeso peroxidasa o peroxidasa versátil tal que la actividad enzimática en el reactor enzimático (etapa I) se encuentre en un rango de 25 a 500 U L-1; y, opcionalmente, cuando el peróxido es generado in situ por la enzima glucosa oxidasa, caracterizado por una velocidad de adición de GOD tal que la relación entre MnP o VP y GOD sea 1, 43 (mgMnP o VP/mgGOD) .

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la adición continua o semicontinua de peróxido de hidrógeno en el reactor enzimático (etapa I) con velocidades comprendidas entre 5 y 100 μmol L-1 min-1;y, opcionalmente, cuando el peróxido de hidrógeno es generado in situ por la enzima glucosa oxidasa, caracterizado por una velocidad mínima de adición de glucosa de 50 μmol L-1 min-1.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la adición al reactor enzimático (etapa I) de agentes quelantes con una velocidad comprendida entre5y250 μmol L-1 min-1.

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la adición al reactor enzimático (etapa I) de manganeso (II) con una velocidad comprendida entre 0, 5 y 100 μmol L-1 min-1.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la operación del reactor enzimático (etapa I) a temperaturas comprendidas entre 10 y 50ºCyavalores de pH comprendidos entre4y8.

10. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la operación del reactor de degradación (etapa II) a temperaturas comprendidas entre 10 y 90ºCyavalores de pH comprendidos entre3y9.

11. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por la operación de un equipo de ósmosis inversa, tras el reactor de degradación (etapa II) , con una relación minina entre los caudales de la corriente de concentrado y la corriente de permeado igual a 2.