Micelas PIC dendríticas con proteínas bioactivas. Se refiere a una micela polimérica de complejo poliiónico (Polyion Complex,

PIC) formada por interacción entre una proteína bioactiva y un copolímero de bloque dendrítico de carga opuesta. La tradicional baja estabilidad de micelas PIC con proteínas bioactivas frente a la fuerza iónica es compensada en la presente invención por la estabilidad que aporta el bloque dendrítico. El proceso global de preparación de estas micelas se ve facilitado por la sencillez de la síntesis de copolímeros de bloque dendríticos

Micelas PIC dendríticas con proteínas bioactivas.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a una micela polimérica de complejo poliiónico (Polyion Complex, PIC) dendrítica que incorpora una proteína bioactiva como uno de los bloques poliiónicos que constituyen la micela. De forma más concreta, la presente invención se refiere a una micela PIC formada por interacción electrostática entre un copolímero de bloque dendrítico y una proteína bioactiva de carga opuesta. La micela puede ser estable en condiciones fisiológicas y tiene aplicaciones en nanomedicina, ingeniería médica y biológica, procesos de transporte de proteínas y fármacos, biotecnología, terapia y diagnóstico.

Antecedentes de la invención

El uso de proteínas bioactivas como agentes terapéuticos ha despertado un enorme interés en las últimas décadas debido a su elevada y selectiva actividad terapéutica. Así, por ejemplo, ciertas enfermedades relacionadas con la deficiencia de algunas enzimas lisosomales sólo pueden ser tratadas por la administración de enzimas exógenas [Enzymes as Drugs 1981, p. 167, J. Wiley]. Entre el amplio número de proteínas terapéuticas, la insulina, una hormona peptídica, es una de las más ampliamente utilizadas, pero son importantes también las enzimas antitumorales (que actúan destruyendo determinadas secuencias de aminoácidos necesarias para el crecimiento de tumores), las enzimas digestivas (para el tratamiento de distintas insuficiencias del tracto digestivo) o las enzimas antibacterianas, antivirales y antiinflamatorias.

Sin embargo, el uso de proteínas como agentes terapéuticos presenta como inconveniente un transporte lento e inefectivo a través de las barreras biológicas, además de un corto tiempo de vida media in vivo provocado por la degradación enzimática y la metabolización. La incorporación de proteínas bioactivas en sistemas de transporte (nanopartículas, liposomas, etc) presenta numerosas ventajas frente a las rutas de administración convencionales. Así, de esta forma, se ha conseguido aumentar la solubilidad y estabilidad de estos agentes terapéuticos frente a la degradación enzimática, mejorar la farmacocinética y, en algunos casos, controlar la liberación de la proteína terapéutica. Sin embargo, hasta el momento, la eficacia de estos sistemas no ha sido demostrada in vivo debido a diversos factores, como por ejemplo, en el caso de liposomas, su falta de estabilidad en medios biológicos [J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2008, 46, 1].

A la hora de diseñar un sistema adecuado para el transporte de proteínas bioactivas, uno de los problemas que se presentan es la pérdida de actividad. Así, debido a la tendencia de proteínas a la desnaturalización, las condiciones de preparación, purificación y almacenamiento están considerablemente limitadas. Además, el sistema de transporte debe ser biocompatible y proteger a la proteína frente a la opsonización por parte del sistema reticuloendotelial (SRE).

En este contexto, las micelas PIC (Polyion Complex) se presentan como un prometedor vehículo de transporte para proteínas bioactivas, ya que permiten la incorporación de las mismas mediante uniones no covalentes y en condiciones fisiológicas, preservando así su actividad. Además, estas micelas poseen una corona formada por un polímero hidrofílico y biocompatible (generalmente Polietilenglicol, PEG) que, una vez en el torrente sanguíneo, evita su reconocimiento y opsonización por parte del sistema inmunológico, asegurando prolongados tiempos de circulación [Pharm. Res. 2001, 18, 1411].

Las micelas PIC [Macromolecules 1995, 28, 5294. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 639] son un tipo de micelas polímericas formadas por interacción electrostática entre polímeros o macromoléculas de carga opuesta, en las que una de las especies es un copolímero de bloque que incorpora un bloque hidrofílico y biocompatible. Son nanoestructuras con una muy baja polidispersión y que presentan un tamaño similar al de virus y lipoproteínas (10-200 nm), lo que facilita enormemente su entrada en las células. Otra ventaja que presentan las micelas PIC es su tendencia a acumularse pasivamente en tumores sólidos gracias al efecto EPR (Enhaced Permeability and Retention) [Cancer Res. 1986, 46, 6387], lo que unido a sus prolongados tiempos de circulación en el torrente sanguíneo, hace que se acumulen selectivamente en los tejidos tumorales.

El primer ejemplo de micela PIC formada por interacción electrostática entre un polímero poliiónico y una proteína fue descrito por Kataoka y colaboradores [Macromolecules 1998, 31, 288]. El propio Kataoka resaltó, no sólo la preservación de la actividad enzimática de ciertas proteínas en el interior de una micela PIC, sino un aumento de la misma como resultado de las especiales propiedades del núcleo de la micela [J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 15306], En este sentido, se ha propuesto que las micelas PIC que contienen proteínas pueden ser consideradas como nano-reactores con aplicaciones en los campos de la ingeniería médica y biológica.

Sin embargo, las micelas PIC formadas a partir de proteínas presentan como desventaja una muy baja estabilidad frente a la fuerza iónica, por lo que su aplicación en sistemas biológicos se ha visto considerablemente limitada. La estabilidad de micelas PIC frente a concentraciones salinas está directamente relacionada con la densidad de cargas de sus componentes. Así, se han descrito micelas PIC estables en medio fisiológico cuando los bloques constituyentes de las micelas presentan una gran densidad de carga, como es el caso de los poliaminoácidos. Sin embargo, la sustitución de un poliaminoácido por una proteína bioactiva provoca la disociación inmediata de las micelas PIC resultantes en condiciones fisiológicas. Este hecho ha sido explicado en base a la baja densidad de carga de las proteínas. Así, mientras un poliaminoácido comercial como Poli-L-lisina presenta una carga positiva por cada ∼200 Da, en una proteína como lisozima hay sólo una carga neta positiva cada ∼2000 Da [Angew. Chem. Int. Ed. 2009, DOI: 10.1002/anie.200900064].

Recientemente se ha puesto de manifiesto un gran aumento en la estabilidad de micelas PIC mediante el uso de dendrímeros [Macromolecules 2003, 36, 1304] y copolímeros de bloque dendríticos [Chem. Comm. 2008, 27, 3136], hecho que se ha atribuido principalmente a la mayor rigidez asociada a este tipo de estructuras. Las micelas PIC construidas a partir de copolímeros de bloque dendríticos presentan como ventaja adicional la facilidad con la que estos copolímeros se sintetizan y por lo tanto un consecuente abaratamiento e idoneidad desde el punto de vista industrial [Chem. Comm. 2008, 27,3136].

De acuerdo con el estado de la técnica anterior conocido y establecido, hasta el momento no se han descrito micelas PIC formadas a partir de copolímeros de bloque dendríticos y proteínas bioactivas.

En la presente invención se demuestra que las micelas PIC que contienen copolímeros de bloque dendríticos son un sistema de transporte óptimo para proteínas bioactivas que resuelven los problemas actuales en el estado de la técnica.

Descripción de la invención

Definiciones

Dendrímero: Polímero altamente ramificado en el que las unidades de repetición se organizan en generaciones a partir de un punto focal. Su tamaño nanométrico y multivalencia hace que sean macromoléculas idóneas para participar en procesos de interacción receptor-ligando.

Copolímero de bloque: Un copolímero es un polímero compuesto por dos o más especies monoméricas. Los copolímeros formados por dos bloques de diferentes monómeros polimerizados se denominan copolímeros de bloque.

Proteínas bioactivas: Macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos que regulan o desempeñan algún proceso biológico. Las proteínas bioactivas se caracterizan por organizarse en cuatro niveles estructurales denominados estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La estructura primaria es una descripción de los enlaces covalentes que unen los distintos aminoácidos de una cadena proteica. La estructura secundaria se refiere a disposiciones particularmente estables de los aminoácidos que dan lugar a patrones estructurales repetitivos. La estructura terciaria describe...

1. Una micela polimérica formada por interacción electrostática entre:

a) un copolímero de bloque dendrítico representado por la fórmula general [1];

donde P es un polímero, D es una estructura dendrítica, q representa el número de átomos cargados en la periferia de la estructura dendrítica que oscila entre 1 y 5000, c representa carga positiva o negativa, y

b) una proteína bioactiva A que presenta una carga neta c' opuesta a c.

2. Una micela polimérica, según la reivindicación 1, donde el polímero P se selecciona preferentemente entre polímeros lineales, copolímeros de bloque, copolímeros, terpolímeros, copolímeros de injerto, terpolímeros de injerto y copolímeros anfifílicos.

3. Una micela polimérica, según la reivindicación 1 y 2, donde el polímero P se selecciona preferentemente entre polímeros de origen natural o polímeros producidos por síntesis química o procesos biotecnológicos.

4. Una micela polimérica, según las reivindicaciones 1, 2 y 3, donde el polímero P se selecciona preferentemente entre N-(2-Hidroxipropil)metacrilamida (HPMA), Poli(estireno-co-ácido maleico/anhídrido) (SMA), Poli(divinil éter anhídrido maleico) (DIYEMA), Poli(N-vinil pirrolidona) (PVP), Poli(N-acriloil)morfolina (PAcM), Polietilenglicol (PEG), Poli(oxido de propileno) (POP) y sus derivados.

5. Una micela polimérica, según las reivindicaciones anteriores, donde el polímero P es preferentemente Polietilenglicol (PEG).

6. Una micela polimérica, según la reivindicación 1, donde la proteína bioactiva A se selecciona preferentemente entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, heteroproteínas, enzimas y hormonas.

7. Una micela polimérica, según las reivindicaciones 1 y 6, donde la proteína bioactiva A se selecciona preferentemente entre mioglobina, lisozima e insulina.

8. Una micela polimérica, según la reivindicación 1, donde la estructura dendrítica D es un dendrímero, dendrón o polímero dendrítico construidos a partir de la misma o diferentes unidades de repetición.

9. Una micela polimérica, según las reivindicaciones 1 y 8, donde D es preferiblemente un dendrón construido a partir de la unidad de repetición representada por la fórmula general [2]

donde Z representa un enlace covalente entre la unidad de repetición y el polímero P o la unidad de repetición de la generación anterior,

R₁ y R₂ son cadenas lineales o ramificadas que pueden ser idénticas o diferentes y que se caracterizan por contener grupos alquilo, alcoholes, tioles, azidas, nitrilos, aminas, imidas, iminas, cianatos, isocianatos, isotiocianatos, éteres, tioéteres, cetonas, aldehídos, ásteres, ácidos carboxílicos o grupos aromáticos,

X representa la unidad de repetición de la siguiente generación o alternativamente un grupo aniónico o catiónico.

10. Una micela polimérica, según la reivindicación 9, donde

Z es preferentemente un enlace amida;

R₁ y R₂ son idénticos y se seleccionan entre cadenas de polietilenglicol u oligoetilenglicol, preferentemente son trietilenglicol;

cuando X es un grupo aniónico se selecciona preferentemente entre ácidos carboxílicos y : sus derivados, sulfatos y sus derivados, sulfonatos y sus derivados, fosfatos y sus derivados, fosfonatos y sus derivados, ácidos arilfosfónicos y sus derivados, fenoles y sus derivados;

cuando X es un grupo de naturaleza catiónica se selecciona preferentemente entre aminas, poliaminas, oligoaminas, preferentemente son espermidinas, esperminas, anilinas, benzilaminas, imidazoles, morfolinas, sales de amonio, aminas primarias, secundarias, terciarias o grupos guanidinio.

11. Una micela polimérica, según la reivindicación 1, caracterizada porque P es PEG, D contiene grupos benzoato en su periferia y A es lisozima.

12. Una micela polimérica, según la reivindicación 1, caracterizada porque P es PEG, D contiene grupos benzoato en su periferia y A es mioglobina.

13. Una micela polimérica, según la reivindicación 1, caracterizada porque P es PEG, D contiene grupos anilina cargados positivamente en su periferia y A es insulina.

14. Una micela polimérica, según las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque un fármaco, agente de diagnóstico, molécula o macromolécula de cualquier naturaleza está encapsulada en su interior.

15. Uso de una micela, según las reivindicaciones de 1 a 14, como vehículo para la administración terapéutica de una proteína bioactiva.

16. Uso de una micela, según las reivindicaciones de 1 a 14, como vehículo para la administración de un fármaco o agente de diagnóstico, molécula o macromolécula de cualquier naturaleza.

17. Composición farmacéutica que comprende una micela según las reivindicaciones de 1 a 14 y un principio activo.