Un kit para monitorizar afecciones de próstata en un sujeto, que comprende:

un primer par de cebadores de PCR para detectar la expresión de DEFB1 en un tejido de dicho sujeto, teniendo preferentemente el primer par de cebadores de PCR las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 35 y 37; un segundo par de cebadores de PCR para detectar la expresión de PAX2 en el mismo tejido de dicho sujeto, seleccionándose preferentemente el segundo par de cebadores de PCR del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43 y 47, SEC ID Nº: 44 y 48 y SEC ID Nº: 45 y 49; y

un tercer par de cebadores de PCR para detectar la expresión de un primer gen de control en el mismo tejido de dicho sujeto, siendo preferentemente el primer gen de control el gen GAPDH o el gen ß-actina y/o seleccionándose preferentemente el tercer par de cebadores de PCR del grupo que consiste en SEC ID Nº: 42 y 46 y SEC ID Nº: 34 y 36.

Composiciones y procedimientos para diagnosticar, tratar y prevenir afecciones de próstata.

ANTECEDENTES

Las actuales quimioterapias anticancerosas que están basadas en agentes alquilantes, antimetabolitos y productos naturales son heterogéneas en su mecanismos de acción. Por consiguiente, la mayoría de las mismas también actúan contra células normales, dando como resultado graves efectos secundarios y toxicidad para el paciente.

La acumulación de mutaciones y la pérdida de las funciones de control celular causan cambios fenotípicos progresivos desde histología normal a pre-cáncer temprano tal como neoplasia intraepitelial (IEN) hasta IEN cada vez más grave hasta cáncer superficial y finalmente hasta enfermedad invasiva. Aunque este proceso puede ser relativamente agresivo en algunos casos, generalmente ocurre de forma relativamente lenta a lo largo de años e incluso décadas. La adicción a oncogenes es la dependencia fisiológica de las células cancerosas de la activación o sobreexpresión continuada de oncogenes individuales para mantener el fenotipo maligno. Esta dependencia ocurre en el entorno de los otros cambios que marcan la progresión neoplásica.

La quimioprevención del cáncer se define como la prevención de cáncer o tratamiento en el estado precanceroso o incluso antes. El largo periodo de progresión hasta cáncer invasivo es una importante oportunidad científica pero también un obstáculo económico para mostrar el beneficio clínico de fármacos quimiopreventivos candidatos. Por lo tanto, un componente importante de la investigación en el desarrollo de agentes quimiopreventivos en los últimos años ha sido identificar criterios de valoración (pre-cáncer) anteriores o biomarcadores que predigan de forma precisa un beneficio clínico del agente o efecto reductor de la incidencia del cáncer. En muchos cánceres, la IEN es un criterio de valoración temprano tal como en próstata.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA

De acuerdo con el fin de esta invención, como se realiza y se describe ampliamente en la presente memoria, esta invención se refiere a composiciones y procedimientos para diagnosticar, prevenir y tratar cáncer de próstata y neoplasia intraepitelial de próstata (PIN) .

Se expondrán ventajas adicionales del procedimiento desvelado y composiciones en parte en la siguiente descripción y en parte se comprenderán a partir de la descripción o se pueden aprender mediante la práctica del procedimiento desvelado y las composiciones. Las ventajas del procedimiento y las composiciones desveladas se realizarán y conseguirán mediante los elementos y combinaciones señalados en particular en las reivindicaciones dependientes. Se ha de entender que tanto la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada son solamente ilustrativas y explicativas y no son limitantes de la invención como se reivindica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria, ilustran varias realizaciones de los procedimientos y composiciones desvelados y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de los procedimientos y las composiciones desvelados.

La Figura 1 muestra análisis de RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) de la expresión de beta-defensina-1 (DEFB1) . Para verificar la inducción de la expresión de DEFB1 se realizó QRT-PCR. La Figura 1A muestra los niveles de expresión relativos de DEFB1 en comparación en muestras clínicas de 6 pacientes que se sometieron a prostatectomías radicales. La Figura 1B muestra los niveles de expresión relativos de DEFB1 en comparación en muestras clínicas prostáticas benignas y malignas, células de hPrEC y en líneas celulares de cáncer de próstata antes y después de la inducción de DEFB1. La Figura 1C muestra los niveles de expresión relativos de DEFB1 analizados en tejido benigno, tejido maligno y neoplasia intraepitelial de próstata (PIN) en una única afección tisular. La Figura 1D muestra la expresión de DEFB1 en tejido benigno, tejido maligno y PIN en un paciente en comparación con el nivel de expresión de DEFB1 promedio encontrado en tejido benigno.

La Figura 2 muestra el análisis microscópico de cambios inducidos por DEFB1 en la integridad de membrana y morfología celular. La morfología celular de DU145, PC3 y LNCaP se analizó mediante microscopía de contraste de fases después de 48 horas de la inducción de DEFB 1. La ondulación de membrana se indica mediante flechas negras y los cuerpos apoptóticos están indicados con flechas blancas.

La Figura 3 muestra el análisis de la Citotoxicidad de DEFB 1 en Células de Cáncer de Próstata. Las líneas celulares de próstata DU145, PC3 y LNCaP se trataron con PonA para inducir la expresión de DEFB1 durante 1-3 días después de lo cual se realizó un ensayo de MTT para determinar la viabilidad celular. Los resultados representan media ± d. t., n=9.

La Figura 4 muestra la inducción de muerte celular en células DU145 y PC3 mediante DEFB1. La expresión de DEFB1 se indujo en líneas celulares de cáncer de próstata DU145 (A) y PC3 (B) y después se sometió a tinción con anexina V/FITC/yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo. Se consideraron apoptóticas las células positivas a yoduro de propidio y anexina V. Los tiempos de inducción se muestran debajo de cada panel. Los números cerca de los recuadros para cada punto de tiempo representan los porcentajes de células yoduro de propidio (PI) - anexina V+ (cuadrante derecho inferior) y células PI+ anexina V+ (cuadrante derecho superior) . Los datos son de un único experimento que es representativo de tres experimentos separados.

La Figura 5 muestra el análisis de pan-caspasa después de la inducción de DEFB1. Las células DU145 y PC3 se tiñeron con fluorometil cetona marcada con FAM-VAD-FMK para detectar la actividad de caspasa. Las células eran visibles bajo DIC para cada estado. El análisis microscópico confocal no mostró tinción de caspasa en células DU145 (B) de control, PC3 (F) y LNCaP (J) . Las células tratadas con PonA durante 24 horas para inducir DEFB1 mostraron actividad de caspasa en DU145 (D) y PC3 (H) . No se detectó actividad de caspasa en LNCaP (L) .

La Figura 6 muestra el silenciamiento de la expresión de la proteína del gen homeótico de caja emparejada 2 (PAX2) después del tratamiento de ARNip de PAX2. La Figura 6A muestra el análisis de transferencia de Western de células PC3 y DU145 transfectadas con dúplex de ARNip de PAX2 el día cero (carril 1) , día dos (carril 2) y el día cuatro (carril 3) . La Figura 6B muestra el análisis de transferencia de Western de células PC3 y DU145 transfectadas con dúplex de ARNip de PAX2 el día cero (carril 1) , día dos (carril 2) , día cuatro (carril 3) y día 6 (carril 4) . La proteína de PAX2 era indetectable tan pronto como después de cuatro días de tratamiento (carril 3) en células DU145 y después de seis días de tratamiento en PC3. Las transferencias se separaron y re-sondaron para β-actina como un control interno.

La Figura 7 muestra el análisis del desarrollo de células de cáncer de próstata después de tratamiento con ARNip de PAX2. El análisis con microscopía de contraste de fases de DU145, PC3 y LNCaP a los 6 días en presencia de medio de cultivo normal. El tratamiento con ARNip de control negativo no tuvo ningún efecto sobre las células. Sin embargo, hubo una reducción significativa en el número de células en las tres líneas después de tratamiento con ARNip de PAX2.

La Figura 8 muestra el análisis de la muerte celular después del silenciamiento de ARNip de PAX2. Las líneas celulares de cáncer de próstata PC3, DU145 y LNCaP se trataron con 0, 5 μg de un conjunto de cuatro ARNip de PAX2 o cuatro ARNip de control no específicos durante 2, 4 o 6 días después de lo cual se realizó el ensayo de MTT para determinar la viabilidad celular. Los resultados representan la media ± d.t., n=9.

La Figura 9 muestra el análisis de la actividad de caspasa. Las células DU145, PC3 y LNCaP se tiñeron con fluorometilcetona marcada con carboxifluoresceína para detectar la actividad de caspasa después de tratamiento con ARNip de PAX2. El análisis de microscopía confocal de células no tratadas y tratadas muestra células que eran visibles con DIC. El análisis con fluorescencia no mostró tinción de caspasa en DU145 (B) de control, células PC3 (F) y células LNCaP (J) . Sin embargo, la célula tratada con ARNip de PAX2 indujo... [Seguir leyendo]

1. Un kit para monitorizar afecciones de próstata en un sujeto, que comprende:

un primer par de cebadores de PCR para detectar la expresión de DEFB1 en un tejido de dicho sujeto, teniendo preferentemente el primer par de cebadores de PCR las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 35 y 37; un segundo par de cebadores de PCR para detectar la expresión de PAX2 en el mismo tejido de dicho sujeto, seleccionándose preferentemente el segundo par de cebadores de PCR del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43 y 47, SEC ID Nº: 44 y 48 y SEC ID Nº: 45 y 49; y un tercer par de cebadores de PCR para detectar la expresión de un primer gen de control en el mismo tejido de dicho sujeto, siendo preferentemente el primer gen de control el gen GAPDH o el gen β-actina y/o seleccionándose preferentemente el tercer par de cebadores de PCR del grupo que consiste en SEC ID Nº: 42 y 46 y SEC ID Nº: 34 y 36.

2. El kit de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un cuarto par de cebadores de PCR para detectar la expresión de un segundo gen de control en el mismo tejido de dicho sujeto, en el que el primer gen de control es preferentemente el gen β-actina y el segundo gen de control es preferentemente el gen GAPDH.

3. El kit de la reivindicación 1 ó 2, que adicionalmente comprende una ADN polimerasa, reactivos para la reacción PCR, una transcriptasa inversa y/o reactivos para la extracción del ARN.

4. Un método ex vivo para monitorizar afecciones de próstata en un sujeto, que comprende:

determinar la proporción de la expresión del gen de caja emparejada 2 con respecto al gen beta defensina-1 (PAX2 con respecto a DEFB1) en células obtenidas de la próstata del sujeto, en el que la proporción de la expresión de PAX2 con respecto a DEFB1 se correlaciona con afecciones prostáticas.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la proporción de la expresión de PAX2 con respecto a DEFB1 de 100:1

o superior es indicativa de la presencia de cáncer de próstata en el sujeto, una proporción de expresión de PAX2 con respecto a DEFB1 de 40:1 o superior, pero inferior a 100:1, es indicativa de la presencia de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en el sujeto y una proporción de expresión de PAX2 con respecto a DEFB1 de menos de 40:1 es indicativa de próstata normal en el sujeto.

6. El método de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que la etapa de determinación comprende:

determinar el nivel de expresión del gen PAX2 con respecto al nivel de expresión de un gen control, siendo preferentemente el gen control el gen GAPDH; determinar el nivel de expresión del gen DEFB1 con respecto al nivel de expresión del mismo gen de control, siendo preferentemente el gen de control el gen GAPDH, y determinar la proporción de la expresión de PAX2 con respecto a DEFB1 basándose en los niveles de expresión de PAX2 y DEFB1, y los niveles de expresión de PAX2, DEFB1 y los genes control se determinan preferentemente mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción