Moduladores de complemento dianas sobre el receptor 2 de complemento.

Una composición que comprende un constructo, en la que el constructo comprende:

(a) una CR2 o un fragmento de la misma, en el que el fragmento contiene al menos los dos primeros dominios de repeticiones de consenso cortas (SCR) N-terminales de la proteína CR2; y

(b) un modulador de la actividad del complemento, en el que la modulación de la actividad del complemento comprende un inhibidor del complemento o fragmento del mismo, en el que dicho inhibidor del complemento se selecciona del factor acelerador del decaimiento (DAF), CD59 humana, CD59 de ratón, Crr y , proteína cofactor de membrana (MCP), receptor 1 del complemento (CR1) y un anticuerpo anti-C5, en el que el fragmento del mismo comprende SCRs 1-4 de DAF, SCRs 2-4 de DAF, CD59 humana soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, CD59 de ratón soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, SCRs 1-5 de Crr y , SCRs 1-4 de MCP, SCRs 1-4 de CR1, SCRs 8-11 de CR1, SCRs 15-18 de CR1 o el sitio de unión C1q de CR1.

Moduladores de complemento dianas sobre el receptor 2 de complemento

I. Antecedentes de la invención

El complemento es un término colectivo para una serie de proteínas sanguíneas, y es un mecanismo efector principal del sistema inmunitario. La activación del complemento y su deposición sobre estructuras diana puede conducir a la lisis celular mediada por el complemento, o puede conducir indirectamente a la destrucción celular o tisular debido a la generación de moduladores poderosos de inflamación y el reclutamiento y activación de células efectoras inmunitarias. Los productos de la activación del complemento que median la lesión tisular se generan en diversos puntos en la ruta del complemento. La activación inapropiada del complemento en tejido hospedante desempeña un papel importante en la patología de muchas enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, y es también responsable de muchos estados mórbidos asociados con bioincompatibilidad, por ejemplo inflamación postcardiopulmonar y rechazo de transplantes. La inhibición del complemento representa una modalidad terapéutica potencial para el tratamiento de tales enfermedades y estados mórbidos mediados inmunitariamente. Se ha demostrado que las proteínas inhibidoras del complemento, que inhiben sistémicamente el complemento, son eficaces en diversos modelos animales de enfermedad (y en unos pocos ensayos clínicos) , pero los inhibidores del complemento que seleccionan como diana un sitio de enfermedad y la activación del complemento ofrecen ventajas potenciales significativas con respecto a la seguridad y eficacia.

En individuos sanos, la deposición del complemento en membranas celulares hospedantes es prevenida por proteínas inhibidoras del complemento expresadas en la superficie celular. Estas proteínas inhibidoras del complemento también son expresadas en la superficie de células tumorales, a menudo en niveles elevados, y se considera que son un factor contribuyente importante a la resistencia de las células tumorales a inmunoterapia mediada por anticuerpos monoclonales (anticuerpos monoclonales que seleccionan como dianas a células tumorales y activan el complemento) .

El sistema del complemento comprende una colección de alrededor de 30 proteínas, y es uno de los mecanismos efectores principales del sistema inmunitario. La cascada del complemento es activada principalmente vía las rutas clásica (habitualmente dependiente de anticuerpos) o alternativa (habitualmente independiente de anticuerpos) . La activación vía cualquier ruta conduce a la generación de C3 convertasa, que es el complejo enzimático central de la cascada. C3 convertasa escinde el C3 del suero en C3a y C3b, uniéndose este último covalentemente al sitio de activación y conduciendo a la generación posterior de C3 convertasa (bucle de amplificación) . El producto de activación C3b (y también C4b generado sólo vía la ruta clásica) y sus productos de ruptura son opsoninas importantes, y están implicadas en promover la lisis de células diana mediada por células (mediante fagocitos y células NK) así como el transporte y solubilización del complejo inmunitario. Los productos de activación C3/C4 y sus receptores sobre diversas células del sistema inmunitario son también importantes a la hora de modular la respuesta inmunitaria celular. Las C3 convertasas participan en la formación de C5 convertasa, un complejo que escinde C5 para producir C5a y C5b. C5a tiene propiedades proinflamatorias y quimiotácticas poderosas, y puede reclutar y activar células efectoras inmunitarias. La formación de C5b inicia la ruta del complemento terminal, dando como resultado el ensamblaje secuencial de proteínas del complemento C6, C7, C8 y (C9) n para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC o C5b-9) . La formación de MAC en una membrana celular diana puede dar como resultado la lisis celular directa, pero también puede provocar la activación celular y la expresión/liberación de diversos moduladores inflamatorios.

Hay dos clases amplias de inhibidores del complemento de la membrana; inhibidores de la ruta de activación del complemento (inhiben la formación de C3 convertasa) , e inhibidores de la ruta del complemento terminal (inhiben la formación de MAC) . Los inhibidores membránicos de la activación del complemento incluyen el receptor 1 del complemento (CR1) , el factor acelerador del decaimiento (DAF) y la proteína cofactor de membrana (MCP) . Todos ellos tienen una estructura proteica que consiste en números variables de unidades que se repiten y alrededor de 60-70 aminoácidos denominadas repeticiones de consenso cortas (SCR) que son una característica común de las proteínas de unión a C3/C4. Se han identificado los homólogos de roedores de los inhibidores de la activación del complemento humanos. La proteína de roedor Crr y es un inhibidor ampliamente distribuido de la activación del complemento que funciona de forma similar tanto a DAF como MCP. Los roedores también expresan DAF y MCP, aunque parece que Crr y es funcionalmente el regulador más importante de la activación del complemento en roedores. Aunque no hay homólogo de Crr y encontrado en humanos, el estudio de Crr y y su uso en modelos animales es clínicamente relevante.

El control en la ruta del complemento terminal y la formación de MAC en membranas celulares hospedantes se produce principalmente a través de la actividad de CD59, una glucoproteína de 20 kD ampliamente distribuida unida a las membranas plasmáticas mediante un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) . CD59 se une a C8 y a C9 en el ensamblaje de MAC, y evita la inserción membránica.

Actualmente están bajo investigación diversos tipos de proteínas inhibidoras del complemento para la terapia de enfermedad inflamatoria y estados mórbidos asociados con bioincompatibilidad. Dos de los inhibidores mejor caracterizados terapéuticamente del complemento humano son una forma soluble del receptor 1 de complemento (sCR1) y un anticuerpo monoclonal anti-C5. Estas proteínas inhibidoras sistémicamente activas han demostrado eficacia en diversos modelos animales de enfermedad, y más recientemente en ensayos clínicos (1-5, 6:#1037) . mAb anti-C5 inhibe la generación de C5a y el MAC, mientras que sCR1 es un inhibidor de la activación del complemento y también inhibe la generación de productos de activación de C3. También se ha demostrado que las formas solubles del factor acelerador del decaimiento humano (DAF) y la proteína cofactor de membrana (MCP) , inhibidores membránicos de la activación del complemento, son protectoras en modelos animales de inflamación y bioincompatibilidad (7-11) . CD59 es un inhibidor membránico del complemento que bloquea el ensamblaje del MAC, pero no afecta a la generación de opsoninas del complemento o C3a y C5a. Se han producido formas solubles de CD59, pero su baja actividad funcional in vitro, particularmente en presencia de suero, indica que sCD59 tendrá poca o ninguna eficacia terapéutica (12-15) .

Es probable que el suministro de inhibidores del complemento a sitios de activación del complemento y a la enfermedad mejore su eficacia. Puesto que el complemento desempeña un papel importante en la defensa del hospedante y en el catabolismo del complejo inmunitario, los inhibidores del complemento dirigidos contra dianas también pueden reducir efectos secundarios potencialmente serios, particularmente con inhibición del complemento a largo plazo. Recientemente, se preparó una forma modificada de sCR1 decorado con sialil Lewis x (sLex) , y se mostró que se une a células endoteliales que expresan selectina P y E. Se demostró que sCR1sLex es un compuesto terapéutico más potente que sCR1 en modelos de roedores de enfermedad inflamatoria (16, 17) . En estudios de viabilidad in vitro, se demostró que las proteínas de fusión anticuerpo-DAF (18) y anticuerpo-CD59 (19) son más eficaces protegiendo células seleccionadas como dianas que células no seleccionadas como dianas frente al complemento. La dianización membránica no específica de inhibidores del complemento recombinantes también se ha logrado acoplando inhibidores a péptidos que se insertan en la membrana (20, 21) .

Los fragmentos de activación de C3 son opsoninas del complemento abundantes encontradas en un sitio de activación del complemento, y sirven como ligandos para diversos receptores de C3. Uno de tales receptores, el receptor 2 del complemento (CR2) , una proteína transmembránica, desempeña un papel importante en la inmunidad humoral por medio de su expresión predominantemente en células B maduras y células dendríticas foliculares (22, 23) . CR2 es un miembro de la familia... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un constructo, en la que el constructo comprende:

(a) una CR2 o un fragmento de la misma, en el que el fragmento contiene al menos los dos primeros dominios de repeticiones de consenso cortas (SCR) N-terminales de la proteína CR2; y

(b) un modulador de la actividad del complemento, en el que la modulación de la actividad del complemento comprende un inhibidor del complemento o fragmento del mismo, en el que dicho inhibidor del complemento se selecciona del factor acelerador del decaimiento (DAF) , CD59 humana, CD59 de ratón, Crr y , proteína cofactor de membrana (MCP) , receptor 1 del complemento (CR1) y un anticuerpo anti-C5, en el que el fragmento del mismo comprende SCRs 1-4 de DAF, SCRs 2-4 de DAF, CD59 humana soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, CD59 de ratón soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, SCRs 1-5 de Crr y , SCRs 1-4 de MCP, SCRs 1-4 de CR1, SCRs 8-11 de CR1, SCRs 15-18 de CR1 o el sitio de unión C1q de CR1.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la CR2 o su fragmento comprende los cuatro dominios de SCR Nterminales de la proteína CR2.

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que la CR2 comprende una proteína CR2 de longitud completa.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el constructo es una proteína de fusión.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que la CR2 o su fragmento se fusiona al término N o al término C del inhibidor del complemento o su fragmento.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 8 SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 14.

7. La composición de la reivindicación 1, en la que el inhibidor del complemento o su fragmento es CD59 murina, CD59 murina sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, CD59 humana sin su anclaje glucofosfatidilinositol, o CD59 humana.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en un método para tratar una afección afectada por el complemento.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en un método para tratar una infección vírica, una infección fúngica o una afección inflamatoria.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que la afección inflamatoria es apoplejía o lesión por reperfusión isquémica.

11. Una secuencia nucleotídica que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 4.