Composiciones y métodos para la humanización y optimización de N-glicanos en plantas.

Una planta de lenteja de agua o una célula o nódulo de lenteja de agua que expresa una glicoproteínarecombinante que tiene un perfil de N-glicosilación sustancialmente homogéneo,

en donde al menos el 90% de lasespecies de N-glicano presentes en el perfil son glicanos G0, y en donde dicha planta, célula vegetal o nódulocomprende al menos una construcción de nucleótido recombinante que proporciona la inhibición de la expresión deα1,3-fucosiltransferasa (FucT) y ß1,2-xilosiltransferasa (XylT) en dicha planta, célula vegetal o nódulo por medio de:(a) la supresión o co-supresión sentido a través de una casete de expresión que expresa una molécula deARN correspondiente a parte o todo el ARN mensajero que codifica una FucT o XylT, o ambas, en laorientación sentido;

(b) la supresión antisentido a través de una casete de expresión que expresa una molécula de ARNcomplementaria a parte o a todo el ARN mensajero que codifica una FucT o XylT, o ambas, en la orientaciónantisentido;

(c) la interferencia de ARN de cadena doble, en donde el ARN sentido de (a) y el ARN antisentido de (b) sonexpresados en la misma célula;

(d)

(i) la interferencia de ARN de horquilla (ARNhp), o

(ii) la interferencia de ARN de horquilla que contiene intrón (ARNihp)a través de una casete de expresión que expresa una molécula de ARN que se hibrida consigo misma paraformar una estructura de horquilla que comprende una región de lazo de cadena sencilla y un tallo de basesemparejadas, en donde la región de tallo de bases emparejadas comprende una secuencia sentidocorrespondiente a parte o a toda la secuencia diana de FucT o XylT, y una secuencia antisentido que esparcial o totalmente complementaria a la secuencia sentido; o

(e) la inhibición de microARN (miARN) a través de una construcción que expresa un ARN que forma unaestructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria a la secuenciadiana de FucT o XylT y que contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia de FucT o XylT en orientaciónsentido y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria a la secuenciasentido.

Composiciones y métodos para la humanización y optimización de N-glicanos en plantas Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas, más particularmente al campo de la 5 producción de proteínas de mamífero recombinantes en plantas.

Antecedentes de la invención Se han seleccionado como diana una serie de especies vegetales para su uso en el “cultivo molecular” de proteínas de mamífero de interés farmacéutico. Estos sistemas de expresión en plantas proporcionan una producción de bajo coste de proteínas de mamífero biológicamente activas y son fácilmente susceptibles de un escalado rápido y

económico (Ma et al. (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 794-805; Raskin et al. (2002) Trends Biotechnol. 20: 522-531) . Un número grande de proteínas de mamífero y de plantas requieren un procesamiento post-traduccional para un plegamiento, un ensamblaje y un funcionamiento adecuados. De estas modificaciones, las diferencias en los modelos de glicosilación entre plantas y mamíferos ofrecen un reto para la posibilidad de que los sistemas de expresión de plantas produzcan proteínas de mamífero recombinantes de alta calidad para uso farmacéutico.

Según los péptidos se desplazan a través del retículo endoplasmático (RE) y los compartimentos de Golgi subcelulares, las cadenas de residuos de azúcares, o glicanos, se unen, dando lugar finalmente a la formación de glicoproteínas. El enlace entre las cadenas de azúcares y el péptido se produce mediante la formación de un enlace químico con solo uno de los cuatro aminoácidos proteicos: asparagina, serina, treonina e hidroxilisina. En base a este modelo de enlace, se han reconocido dos tipos básicos de cadenas de residuos de azúcares en las glicoproteínas: la cadena de azúcar ligada mediante N-glicósido (también denominada glicano N-ligado o N-glicano) , que se une a los residuos de asparagina del péptido; y la cadena de azúcar ligada mediante O-glicósido, que se une a los residuos de serina, treonina e hidroxilisina del péptido.

Las cadenas de azúcares ligadas mediante N-glicósido, o N-glicanos, presentan diversas estructuras (véase, por ejemplo, Takahashi, ed. (1989) Biochemical Experimentation Method 23 – Method for Studying Glycoprotein Sugar 25 Chain (Gakujutsu Shuppan Center) , pero comparten un núcleo oligomanosídico común (véase la Figura 29A) . Las etapas iniciales de la ruta de glicosilación que conducen a la formación de N-glicanos se conservan en plantas y animales. Sin embargo, las etapas finales implicadas en la formación compleja de N-glicanos difieren (Lerouge et al. (1998) Plant Mo. Biol. 38: 31-48; Steinkellner y Strasser (2003) Ann. Plant Rev. 9: 181-192) . Las plantas producen glicoproteínas con N-glicanos complejos que tienen un núcleo que porta dos residuos de N-acetilglucosamina 30 (GlcNAc) que es similar al observado en mamíferos. Sin embargo, en las glicoproteínas vegetales dicho núcleo está sustituido por un residuo de xilosa º1, 2-ligada (xilosa de núcleo) , residuo que no se da en humanos, epítopos de Lewisa y una fucosa a1, 3-ligada (a[1, 3]-fucosa de núcleo) en lugar de una fucosa a1, 6-ligada de núcleo como en los mamíferos (véase, por ejemplo, Lerouge et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 31-48 para una revisión) (véase también la Figura 29B) . Se ha publicado que tanto los residuos de a (1, 3) -fucosa como los de º (1, 2) -xilosa son, al menos en parte, responsables de la inmunogenicidad de las glicoproteínas vegetales en mamíferos (véase, por ejemplo, Ree et al. (2000) J. Biol. Chem. 15: 11451-11458; Bardor et al. (2003) Glycobiol. 13: 427-434; Garcia-Casado et al. (1996) Glycobiol. 6: 471-477) . Por lo tanto, la eliminación de estos residuos de azúcar potencialmente alergénicos de las glicoproteínas de mamífero producidas recombinantemente en plantas solucionaría las preocupaciones sobre el uso de dichas proteínas como productos farmacéuticos para el tratamiento de humanos.

Actualmente una serie de glicoproteínas producidas recombinantemente actúan como agentes terapéuticos o están bajo investigación clínica. Los ejemplos incluyen los interferones (IFNs) , la eritropoietina (EPO) , el activador de plasminógeno de tejido (tPA) , la antitrombina, el factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) y los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mABs) . El componente de oligosacárido de las estructuras de Nglicano de las glicoproteínas puede influir en su eficacia terapéutica, así como en su estabilidad física, su resistencia 45 al ataque de proteasas, su farmacocinética, su interacción con el sistema inmune y su actividad biológica específica. Véase, por ejemplo, Jenkins et al. (1996) Nature Biotechnol. 14: 975-981. Strasser et al. (2003) FEBS LETTERS:

561: 132-136) describe plantas de Arabidopsis con un modelo de N-glicosilación alterado, que se caracteriza por una reducción de la unión de residuos de a1, 3-fucosa y º1, 2-xilosa a los N-glicanos de las glicoproteínas.

Se necesitan otros métodos adicionales para alterar el modelo de glicosilación en sistemas de expresión vegetales,

específicamente para inhibir la glicosilación específica de planta de la estructura de núcleo eucariótico, para producir de forma ventajosa proteínas de mamífero recombinantes con un modelo de glicosilación humanizado.

Breve resumen de la invención Se proporcionan métodos para alterar el modelo de N-glicosilación de proteínas en plantas superiores. Los métodos comprenden transformar de manera estable la planta con al menos una construcción de nucleótido recombinante 55 que proporcione la inhibición de la expresión de a1, 3-fucosiltransferasa (FucT) y de º1, 2-xiloxiltransferasa (XylT) en una planta. El uso de estas construcciones para inhibir o suprimir la expresión de uno o ambas enzimas, y sus isoformas, proporciona de forma ventajosa la producción de proteínas endógenas y heterólogas que tienen un

modelo de N-glicosilación “humanizado” sin afectar al crecimiento y al desarrollo de la planta. Se proporcionan las plantas superiores transformadas de manera estable que presentan este modelo de N-glicosilación de proteína. La planta es una lenteja de agua, es decir, un miembro de la familia Lemnaceae, por ejemplo, una Lemna sp.

Las plantas transgénicas de la invención tienen la capacidad de producir proteínas de mamífero recombinantes que tienen un modelo de N-glicosilación que es más similar al del hospedante mamífero. Por tanto, en algunas realizaciones, las proteínas de mamífero producidas recombinantemente son glicoproteínas que comprenden Nglicanos que presentan una reducción en la unión de los residuos de a (1, 3) -fucosa y º (1, 2) -xilosa específicos de plantas. En otras realizaciones, estas glicoproteínas producidas recombinantemente comprenden N-glicanos complejos que están desprovistos de estos residuos específicos de plantas. En otras realizaciones adicionales, estas glicoproteínas producidas recombinantemente tienen GlcNAc2Man3GlcNAc2 como única especie de glicano unida a el (los) sitio (s) de glicosilación de asparagina dentro de la glicoproteína.

En algunas realizaciones, la glicoproteína producida recombinantemente es un anticuerpo monoclonal. De este modo, la presente invención proporciona plantas transgénicas que son capaces de producir anticuerpos monoclonales de glicano optimizado que se unen específicamente a una proteína diana de interés, que incluyen anticuerpos monoclonales que tienen una función efectora aumentada. Por tanto, en algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales de glicano optimizado producidos recombinantemente comprenden N-glicanos complejos que presentan una reducción en la unión de residuos de fucosa a (1, 3) -ligados, aumentando con ello la actividad ADCC de dichos anticuerpos. En otras realizaciones, los anticuerpos monoclonales producidos recombinantemente comprenden glicanos complejos N-ligados que están desprovistos de dichos residuos de fucosa específicos de plantas. De esta manera, la presente invención proporciona la producción de una composición de anticuerpos monoclonales, en donde al menos el 90% o más del anticuerpo intacto está representado por una única glicoforma, más particularmente, por la glicoforma G0. Por tanto, en algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos monoclonales producidos recombinantemente presentan una función efectora incrementada, en donde la actividad ADCC aumenta y/o la relación de actividad ADCC/CDC aumenta. En algunas de estas realizaciones, los anticuerpos monoclonales producidos recombinantemente presentan una actividad CDC disminuida, lo que puede reducir de manera ventajosa el potencial de efectos secundarios adversos... [Seguir leyendo]

1. Una planta de lenteja de agua o una célula o nódulo de lenteja de agua que expresa una glicoproteína recombinante que tiene un perfil de N-glicosilación sustancialmente homogéneo, en donde al menos el 90% de las especies de N-glicano presentes en el perfil son glicanos G0, y en donde dicha planta, célula vegetal o nódulo comprende al menos una construcción de nucleótido recombinante que proporciona la inhibición de la expresión de a1, 3-fucosiltransferasa (FucT) y º1, 2-xilosiltransferasa (XylT) en dicha planta, célula vegetal o nódulo por medio de:

(a) la supresión o co-supresión sentido a través de una casete de expresión que expresa una molécula de ARN correspondiente a parte o todo el ARN mensajero que codifica una FucT o XylT, o ambas, en la orientación sentido;

(b) la supresión antisentido a través de una casete de expresión que expresa una molécula de ARN complementaria a parte o a todo el ARN mensajero que codifica una FucT o XylT, o ambas, en la orientación antisentido;

(c) la interferencia de ARN de cadena doble, en donde el ARN sentido de (a) y el ARN antisentido de (b) son expresados en la misma célula;

(d)

(i) la interferencia de ARN de horquilla (ARNhp) , o

(ii) la interferencia de ARN de horquilla que contiene intrón (ARNihp)

a través de una casete de expresión que expresa una molécula de ARN que se hibrida consigo misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región de lazo de cadena sencilla y un tallo de bases emparejadas, en donde la región de tallo de bases emparejadas comprende una secuencia sentido correspondiente a parte o a toda la secuencia diana de FucT o XylT, y una secuencia antisentido que es parcial o totalmente complementaria a la secuencia sentido; o (e) la inhibición de microARN (miARN) a través de una construcción que expresa un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria a la secuencia diana de FucT o XylT y que contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia de FucT o XylT en orientación sentido y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria a la secuencia sentido.

2. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de la reivindicación 1, en donde dichos N-glicanos están desprovistos de dichos residuos de fucosa y xilosa.

3. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde dicha glicoproteína es una proteína de mamífero de interés.

4. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha glicoproteína es un anticuerpo monoclonal de interés.

5. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de la reivindicación 4, en donde dicho anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión para un FcyRlll incrementada, una actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementada, una actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) disminuida, o cualquier combinación de las mismas, como resultado de dicho modelo de Nglicosilación alterado de dicho anticuerpo monoclonal.

6. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha planta, célula vegetal o nódulo comprende una construcción de nucleótidos integrada establemente en su genoma, en donde la construcción se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una construcción de nucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos que es capaz de inhibir la expresión o la función una a1, 3-fucosiltransferasa (FucT) en una planta, y una segunda secuencia de nucleótidos que es capaz de inhibir la expresión o la función de una º1, 2-xilosiltransferasa (XylT) en una planta, en donde dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha segunda secuencia de nucleótidos están ligadas operativamente a al menos un promotor que es funcional en una célula vegetal; y

(b) una construcción de nucleótidos que comprende un polinucleótido de fusión que es capaz de inhibir la expresión o la función de una a1, 3-fucosiltransferasa (FucT) y una º1, 2-xilosiltransferasa (XylT) en una planta, en donde dicho polinucleótido de fusión está ligado operativamente a un promotor que es funcional en una célula vegetal.

7. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha planta, célula vegetal o nódulo comprende:

(a) una primera construcción de nucleótidos que comprende una secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función a1, 3-fucosiltransferasa (FucT) en una planta, en donde dicha secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función de dicha FucT comprende en la orientación 5’a-3’ y ligados operativamente:

i. un fragmento de FucT directo, comprendiendo dicho fragmento de FucT directo entre aproximadamente 500 y aproximadamente 800 nucleótidos contiguos que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 500 a aproximadamente 800 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que codifica dicha FucT;

ii. una secuencia espaciadora que comprende de aproximadamente 200 a aproximadamente 700 nucleótidos; y

iii. un fragmento de FucT inverso, presentando dicho fragmento de FucT inverso una longitud suficiente y una complementariedad suficiente respecto a dicho fragmento de FucT directo como para que dicha secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función de dicha FucT sea transcrita como una molécula de ARN capaz de formar una estructura de ARN de horquilla; en donde dicha secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función de dicha FucT está ligada operativamente a un promotor que es funcional en una célula vegetal; y

(b) una segunda construcción de nucleótidos que comprende una secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función º1, 2-xilosiltransferasa (XylT) en una planta, en donde dicha secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función de dicha XylT comprende en la orientación 5’a-3’ y ligados operativamente:

i. un fragmento de XylT directo, comprendiendo dicho fragmento de XylT directo entre aproximadamente 500 y aproximadamente 800 nucleótidos contiguos que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 500 a aproximadamente 800 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que codifica dicha XylT;

ii. una secuencia espaciadora que comprende de aproximadamente 200 a aproximadamente 700 nucleótidos; y

iii. un fragmento de XylT inverso, presentando dicho fragmento de XylT inverso una longitud suficiente y una complementariedad suficiente respecto a dicho fragmento de XylT directo como para que dicha secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función de dicha XylT sea transcrita como una molécula de ARN capaz de formar una estructura de ARN de horquilla; en donde dicha secuencia de polinucleótido que es capaz de inhibir la expresión o la función de dicha XylT está ligada operativamente a un promotor que es funcional en una célula vegetal.

8. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha lenteja de agua pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en el género Spirodela, género Wolffia, género Wolfiella, género Landoltia y género Lemna.

9. La planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de la reivindicación 8, en donde dicha lenteja de agua es un miembro de una especie seleccionada del grupo que consiste en Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis y Lemna gibba.

10. Un método para usar la planta de lenteja de agua o la célula vegetal o nódulo de lenteja de agua de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para producir una composición de glicoproteínas que tiene un perfil de Nglicosilación sustancialmente homogéneo, en donde al menos el 90% de las especies de N-glicano presentes en el perfil son glicanos G0, comprendiendo dicho método:

(a) cultivar dicha planta de lenteja de agua o célula vegetal o nódulo de lenteja de agua en un medio de cultivo en las condiciones que son adecuadas para la expresión de dicha glicoproteína; y,

(b) recolectar dicha glicoproteína de dicha planta de lenteja de agua, célula vegetal o nódulo, o dicho medio de cultivo;

produciendo con ello dicha composición de glicoproteína.

11. El método de la reivindicación 10, en el que dicha glicoproteína es un anticuerpo monoclonal.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde dicho anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión a un FcyRlll incrementada, una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementada, una actividad citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) disminuida, o cualquier combinación de las mismas, como resultado de dicho modelo de N-glicosilación alterado de dicho anticuerpo monoclonal.