Elementos de control de la expresión de la familia de Lemnaceae.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo queconsiste en:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 350 nucleótidos contiguos de la secuenciamostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en unacélula vegetal, y en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende una caja TATA;

c) una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento funcional de la secuencia mostrada en elSEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicho fragmento inicia la transcripción en una célula vegetal;

d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de almenos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicha secuencia de nucleótidosinicia la transcripción en una célula vegetal; y

e) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con un complemento de unasecuencia de nucleótidos de a), en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en unacélula vegetal.

Elementos de control de la expresión de la familia de Lemnaceae Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para intensificar la expresión génica en plantas.

Antecedentes de la invención Las lentejas de agua son los únicos miembros de la familia de monocotiledóneas Lemnaceae. Los cinco géneros y 38 especies son todas plantas de agua dulce, que flotan libremente, pequeñas cuyo ámbito geográfico abarca todo el mundo (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae - A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich) ) . Aunque son las plantas morfológicamente más reducidas conocidas, la mayor parte de las lentejas de agua tienen todos los tejidos y órganos de plantas mucho más grandes, incluyendo raíces, tallos, flores, semillas y frondas. Las especies de lentejas de agua se han estudiado exhaustivamente y existe una bibliografía sustancial que detalla su ecología, sistemática, ciclo de vida, metabolismo, susceptibilidad a enfermedades y plagas, su biología reproductiva, estructura genética, y biología celular (Hillman (1961) Bot. Review 27:221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae - A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich) ) .

El hábito de crecimiento de las lentejas de agua es ideal para los métodos de cultivo microbiano. La planta proliferan rápidamente a través de brotación vegetativa de nuevas frondas, de una manera macroscópica análoga a la propagación asexual en levadura. Esta proliferación se produce por medio de brotación vegetativa de células meristemáticas. La región meristemática es pequeña y se encuentra sobre la superficie ventral de la fronda. Las células meristemáticas se encuentran en dos bolsillos, uno a cada lado del nervio central de la fronda. La pequeña región del nervio central también es el lugar a partir del cual se origina la raíz y surge el tallo que conecta cada fronda con su fronda madre. El bolsillo meristemático está protegido por una solapa de tejido. Las frondas brotan alternativamente de estos bolsillos. El tiempo de duplicación varía entre especies y es tan breve como 20-24 horas (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko y Mudd (1970) Plant. Physiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 316) .

El cultivo intensivo de la lenteja de agua da como resultado las mayores tasas de acumulación de biomasa por unidad de tiempo (Landolt y Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae - A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistr y , Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich) ) , oscilando la acumulación de peso seco de 6 a 15% del peso húmedo (Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ben. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, datos no publicados) . Se ha informado de que el contenido de proteína de numerosas especies de lenteja de agua desarrolladas en condiciones variables oscila de 15 a 45% de peso seco (Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang y Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251) . Utilizando estos valores, el nivel de producción de proteína por litro de medio en la lentaje de agua es del mismo orden de magnitud que los sistemas de expresión génica de levaduras.

Los cultivos de plantas de lenteja de agua de o nódulos de lenteja de agua se pueden transformar eficazmente con una casete de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos de interés por medio de cualquiera de los numerosos métodos incluyendo la transferencia génica mediada por Agrobacterium, el bombardeo balístico, o la electroporación. Los transformantes de lenteja de agua estables se pueden aislar transformando las células de la lenteja de agua tanto con la secuencia de nucleótidos de interés como con un gen que confiere resistencia a un agente de selección, seguido de cultivo de las células transformadas en un medio que contiene el agente de selección. Véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.040.498 de Stomp et al.

El análisis por deleción del promotor rbcS de lenteja de agua fue descrito por Rolfe et al. (1991) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2683.

Un sistema de expresión génica de lenteja de agua proporciona la tecnología esencial que sería útil para numerosas aplicaciones de investigación y comerciales. Para la investigación sobre la biología molecular vegetal en conjunto, un sistema vegetal diferenciado que se puede manipular con la facilidad de la levadura en el laboratorio proporciona un sistema muy rápido en el cual analizar los papeles evolutivos y fisiológicos de genes aislados. Para la producción comercial de polipéptidos valiosos, un sistema basado en la lenteja de agua tiene numerosas ventajas sobre los sistemas de cultivo microbianos o celulares existentes. Las plantas demuestran un procesamiento post-traduccional que es similar al de las células de mamíferos, superando un problema principal asociado con la producción en células microbianas de polipéptidos de mamífero biológicamente activos, y ha sido demostrado por otros que los sistemas vegetales tienen la capacidad de ensamblar proteínas de múltiples subunidades, una capacidad de la que a menudo carecen los sistemas microbianos (Hiatt (1990) Nature 334:469) . El aumento a escala de la biomasa de lenteja de agua a los niveles necesarios para la producción comercial de proteínas recombinantes es más rápido y tiene un coste más eficaz que el aumento a escala similar de las células de mamífero, y a diferencia de otros sistemas de producción vegetal sugeridos, por ejemplo, soja y tabaco, la lenteja de agua se puede desarrollar en recipientes de producción de biomasa completamente integrados y controlados, haciendo bastante más fácil la integración del sistema en la infraestructura industrial de producción de proteínas existente.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de composiciones y métodos optimizados para expresar proteínas de interés en lenteja de agua.

Breve resumen de la invención Se proporcionan composiciones y métodos para la regulación de la expresión génica en una planta. Las composiciones incluyen secuencias de nucleótidos novedosas para elementos de control de la expresión (p. ej., promotores e intrones) aislados del gen de ubicuitina de Lemnaceae. Los elementos para el control de la expresión de la invención inician la transcripción de las secuencias de nucleótidos heterólogas conectadas operablemente en plantas. Más concretamente, las composiciones de la invención incluyen el elemento para el control de la expresión mostrado en el SEQ ID NO: 1, y las variantes y fragmentos del mismo.

También se proporciona un péptido señal de quitinasa de Lemnaceae novedoso mostrado en el SEQ ID NO: 16, codificado por una secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 15, y las variantes y fragmentos del mismo. La secuencia que codifica el péptido señal se pueden conectar operablemente a una secuencia codificante para un polipéptido de interés para dirigir la secreción extracelular del polipéptido codificado.

Se proporcionan constructos de expresión (p. ej., casetes y vectores) que comprenden un elemento de control de la expresión de la invención conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Se proporcionan adicionalmente plantas, células vegetales y nódulos transformados establemente que tienen un constructo de expresión de la invención.

Las composiciones de la invención encuentran uso en los métodos dirigidos a la expresión de secuencias de nucleótidos de interés en una planta o célula o nódulo vegetal. Los métodos de la invención incluyen la introducción en una planta o célula o nódulo vegetal de un constructo de expresión que tiene un elemento de control de la expresión de ubicuitina de Lemnaceae (p. ej., como se muestra en el SEQ ID NO: 1) , o una variante o fragmento del mismo, conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés.

Los métodos incluyen la introducción en una planta o célula o nódulo vegetal de un constructo de expresión que tiene una secuencia que codifica un péptido señal de quitinasa de Lemnaceae (p. ej., como se muestra en el SEQ ID NO: 15) , o una variante o fragmento del mismo, conectado operablemente a la secuencia codificante de un polipéptido de interés.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención están dirigidos a la producción de un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de interés en un sistema... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 350 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal, y en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende una caja TATA;

c) una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento funcional de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicho fragmento inicia la transcripción en una célula vegetal;

d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal; y

e) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con un complemento de una secuencia de nucleótidos de a) , en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal.

2. Un constructo de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El constructo de expresión de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés conectada operablemente.

4. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta o célula o nódulo vegetal, comprendiendo dicho método introducir en la planta o célula o nódulo vegetal un constructo de expresión, comprendiendo dicho constructo de expresión un elemento de control de la expresión conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde dicho elemento de control de la expresión comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 350 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal, y en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende una caja TATA;

c) una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento funcional de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicho fragmento inicia la transcripción en una célula vegetal;

d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal; y

e) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con un complemento de una secuencia de nucleótidos de a) , en donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal.

5. El constructo de expresión de la reivindicación 3 o el método de la reivindicación 4, en donde dicho constructo de expresión comprende adicionalmente una secuencia codificante de un péptido señal conectada operablemente que dirige la secreción de un polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés al medio de cultivo.

6. El constructo de expresión de la reivindicación 5, o el método de la reivindicación 5, en donde dicho péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 16;

b) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 16, en donde dicha secuencia dirige la secreción de dicho polipéptido al medio de cultivo; y

c) un fragmento funcional de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 16, en donde dicha secuencia dirige la secreción de dicho polipéptido al medio de cultivo.

7. El constructo de expresión de la reivindicación 6, o el método de la reivindicación 6, en donde dicha secuencia codificante de dicho péptido señal comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 15;

b) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 15; y

c) un fragmento de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 15.

8. El constructo de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 5 a 7, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un polipéptido de mamífero.

9. El constructo de expresión de la reivindicación 8, o el método de la reivindicación 8, en donde dicho polipéptido de mamífero se selecciona del grupo que consiste en insulina, hormona del crecimiento, interferón

of interferón ºf glucocerebrosidasaf º-glucoronidasa, proteína de retinoblastoma, proteína p53, angiostatina, leptina, eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos, plasminógeno, anticuerpos monoclonales, fragmentos Fab, anticuerpos de cadena sencilla, citoquinas, receptores, vacunas humanas, vacunas animales, péptidos, albúmina de suero, y combinaciones de los mismos.

10. Una planta o célula o nódulo vegetal transformados que comprenden el constructo de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 ó 5 a 9.

11. Una planta o célula o nódulo vegetal transformados de la reivindicación 10, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde dicha planta o célula o nódulo vegetal es un monocotiledónea.

12. Una planta o célula o nódulo vegetal transformados de la reivindicación 11, o el método de la reivindicación 11, en donde dicha monocotiledónea es de un género seleccionado del grupo que consiste en el género Spirodela, el género Wolffia, el género Wolfiella, el género Landoltia, y el género Lemna.

13. La planta o célula o nódulo vegetal transformados de la reivindicación 12, o el método de la reivindicación 12, en donde dicha monocotiledónea es un miembro de una especie seleccionada del grupo que consiste en Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, y Lemna gibba.

14. La planta o célula o nódulo vegetal transformados de la reivindicación 10, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde dicha planta o célula o nódulo vegetal es una dicotiledónea.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende los codones preferidos por la lenteja de agua en la secuencia codificante de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.

16. El método de la reivindicación 15, en donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende entr.

7. 100% de los codones preferidos por la lenteja de agua.