La invención se relaciona con variantes del dominio N-terminal de activación de transcripción de p300 que presentan mutaciones en los sitios de fosforilación dando lugar a mutantes no fosforilables y que carecen de actividad transcripcional o de mutantes que mimetizan restos residuos fosforilados dando lugar a variantes constitutivamente activas de p300.

Las variantes de p300 se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, infecciones, etc.

Composiciones y métodos para modular la actividad de p300.

Campo técnico de la invención La invención se relaciona con composiciones útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con una activación o una inhibición indeseadas de factores de transcripción que requieren de p300 como co-activador. En particular, las composiciones de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, infecciones, etc.

Antecedentes de la invención Las proteínas p300 y CBP son importantes reguladores de la transcripción inducible en células eucariotas. Estas proteínas fueron identificadas originalmente como proteínas que interaccionaban con el factor de transcripción CREM y con la proteína adenoviral E1A. Los co-activadores actúan de dos formas distintas. Por un lado, actúan como un puente molecular conectando los factores de transcripción con la maquinaria transcripcional, incluyendo TBP, TFIIIB, TFIID y la ARN polimerasa II. Por otro lado, CBP y p300 son capaces de acevilar histonas en la cromatina del promotor diana gracias a la actividad histona acetiltransferasa (HAT) presente en su región C-terminal, lo que provoca un cambio conformacional en la cromatina adquiriendo una estructura abiertas. CBP/p300 interaccionan con y aumentan la transactivación de una variedad de factores de transcripción, incluyendo p53, factores de la familia E2F, CREB, NF-AT, NF-κB y AP-1, coordinando la transcripción de los genes dianas. Por tanto, CBP y p300 están implicados en la regulación de múltiples procesos celulares, incluyendo proliferación, diferenciación, supresión tumoral, transformación maligna y varias alteraciones inmunológicas.

Por tanto, resulta de interés el disponer de agentes que permiten modular la actividad de p300, tanto mediante su estimulación como mediante su inhibición. Inhibidores de la actividad transcripcional de p300 basados en la inhibición de la actividad acetil transferasa han sido descritos en el estado de la técnica. Así, WO03027279 describe una proteína que se une a la región rica en cisteína/histidina de p300 inhibiendo su actividad histona acetiltransferasa, Zheng et al.

(J. Am. Chem. Soc. 2005 Dec 14; 127 (49) : 17182-3) han descrito un inhibidor de la actividad histona acetiltransferasa de p300 formado por un análogo de coenzima A acoplado mediante un puente disulfuro a un resto de oligoarginina que promueve el transporte a través de membranas; Balasubramanyam, K. et al (J. Biol. Chem. 279:51163-71) han descrito la capacidad de la curcumina de inhibir la actividad histona acetiltransferasa de p300; Stimson et al (Mol. Cancer Ther., 2005, 10:1521-32) han descrito compuestos isotiazolónicos que inhiben la actividad histona acetiltransferasa de p300 y la solicitud de patente japonesa JP2000139464 describe oligonucleótidos antisentido dirigidos contra p300 y CBP y su uso para el tratamiento de la leucemia.

CBP/p300 contienen dos dominios que presentan actividad transcripcional, uno de ellos localizado en el extremo N-terminal y el otro en el extremo C-terminal, que pueden actuar independientemente e interaccionar simultáneamente con la maquinaria transaccional y/o con diferentes factores de transcripción para generar la actividad transcripcional mediada por co-activadores. La transactivación mediante por CBP y p300 se regula a través de múltiples vías de señalización que resultan en distintos tipos de modificaciones post-traduccionales de los dominios de transactivación, incluyendo sumoilación, fosforilación, metilación y auto-acetilación. Entre ellas, la forsforilación parece ser una de las modificaciones de mayor importancia dado que la actividad HAT de CBP y p300 se ve aumentada por la quinasas MAP p42 y o44, CaMK IV, PKA, Akt y IKK-alpha. Por otro lado, la actividad transcripcional de CBP/p300 está controlada negativamente por el complejo ciclina e/cdk-2 o por la fosforilación por la proteína quinasa delta (PKC-δ) .

Por tanto, es posible regular la actividad de p300 mediante la modificación del estado de fosforilación. Sin embargo, a pesar de que se conoce la relación entre fosforilación y actividad, los sitios exactos de fosforilación y las quinasas responsables son desconocidos. Yuan et al (Biochim Biophys Acta. 2002, 1592:205-11) han descrito la capacidad de la proteína quinasa delta de fosforilar la serina en posición 89 de p300 provocando la inhibición de la actividad histona acetiltransferasa.

Por tanto, existe una necesidad en la de técnica de agentes capaces de modificar los patrones fisiológicos de fosforilación de la proteína p300/CBP y que permitan regular a voluntad la actividad de p300.

Compendio de la invención En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (amino ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) o una variante de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y que carece de actividad trans-activadora de la transcripción.

En otro aspecto la invención se relaciona con un polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO: 1 (amino ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada.

En aspectos adicionales, la invención se relaciona con construcciones génicas que comprenden los polinucleótidos de la invención, con vectores que comprenden los polinucleótido de la invención o las construcciones génicas de la invención, con células que comprende los polipéptidos de la invención, los polinucleótidos de la invención, los vectores de la invención o las construcciones génicas de la invención y con animales transgénicos no humano que comprende, integrado en su genoma, los polinucleótidos de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido de la invención, con un polinucleótido de la invención, con una construcción génica de la invención, con un vector de la invención para su uso en medicina.

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y que carece de actividad trans-activadora de la transcripción para el tratamiento de enfermedades causados por una activación indeseada de las proteínas p300, NF-κB, NFAT y/o c-jun.

En otro aspecto la invención se relaciona con un polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO: 1 cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada para el tratamiento de enfermedades causados por una inhibición indeseada de las proteínas p300, NF-κB, NFAT y/o c-jun Breve descripción de las figuras Figura 1. La proteína viral A238L inhibe la interacción entre el extremo N-terminal TAD de p300 y PKC. Células Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L se transfectaron con diferentes mutantes GAL4-p300. A, GAL4-p300 FL; B, GAL4p300 1-1301; C, GAL4-p300 192-703; y D, GAL4-p300 1239-2414, como se ha descrito en Materiales y Métodos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron en ausencia o presencia de PMA/Ion durante 4 h, y los extractos nucleares se inmunoprecipitaron con 4 μg de anticuerpo policlonal de conejo contra PKC, o con IgG como control negativo. Los inmunoprecipitados se analizaron por Western Blot con el mismo anticuerpo (αPKC) para determinar los niveles de proteínas en el precipitado, y con anti-GAL4 (αGAL4) para detectar los niveles de PKC asociada con la correspondiente forma mutante de p300. El análisis densitométrico muestra la relación entre PKC coinmunoprecipitada y p300 presente en el precipitado, de tres experimentos independientes (mean ± S.D) . E, La inmunoprecipitación de PKC se analizó por Western blot con un anticuerpo anti-SV5 para detectar los niveles de A238L-SV5 asociada a PKC. El análisis densitométrico muestra la relación entre A238L coinmunoprecipitada y PKC presente en el precipitado, de tres experimentos independientes (mean ± S.D) . F, En paralelo, la PKC inmunoprecipitada se usó en un ensayo kinasa in vitro, utilizando como sustrato MBP purificado. Las proteínas se separaron mediante un gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12% y se reveló mediante autoradiografía. El análisis densitométrico muestra la relación entre MBP [32P] fosforilado y PKC inmunoprecipitada, de tres experimentos independientes (mean ± S.D) .

Figura 2. La fosforilación de la Serina 384 por PKC-θ, representa un paso esencial en la activación transcripcional... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO: 1 cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1 en donde dicha variante comprende en posición 193 de la secuencia SEQ ID NO: 1 un análogo estructural de un fosfoaminoácido.

3. Un polipéptido según la reivindicación 2 en donde el amino ácido en posición 193 en la secuencia de SEQ ID NO: 1 es Asp.

4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido tal que definido en las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 4 o una construcción génica según la reivindicación 5.

7. Una célula que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación5ºunvector según la reivindicación 6.

8. Un animal transgénico no humano que comprende, integrado en su genoma, un polinucleótido según la reivindicación 4.

9. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 15 o un vector según la reivindicación 6 para su uso en medicina.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones1a3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos causados por una inhibición indeseada de la actividad de las proteínas p300, NF-κB, NF-AT y/o c-jun.

12. Uso según la reivindicación 11 en done el trastorno está causado por una inhibición indeseada de la actividad la proteína NF-κB.

13. Uso según la reivindicación 12 en donde el trastorno causado por una inhibición indeseada de la actividad la proteína NF-κB se selecciona del grupo de una enfermedad asociada a la apoptosis, una enfermedad asociada al sistema inmune, una enfermedad de los vasos sanguíneos, un defecto cutáneo, un defecto dental, osteopetrosis, un defecto oftalmológico, un defecto neurológico e incontinentia pigmenti.

14. Uso según la reivindicación 13 en donde el trastorno causado por una inhibición indeseada de la actividad la proteína NF-AT se selecciona del grupo de una enfermedad hipoinmune, una enfermedad infecciosa y un trastorno debido a una inhibición del desarrollo en algún órgano durante el desarrollo.

15. Un método para la identificación de compuestos antitumorales que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una célula que comprende

(a) un polipéptido de fusión que comprende un primer componte formado por la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada y un segundo componente formado por un dominio de unión a ADN y

(b) un gen reportero acoplado operativamente a un promotor que comprende al menos una copia del sitio al que se une el dominio de unión de ADN presente en el polipéptido (i)

con un compuesto cuya actividad antitumoral se desea ensayar y (ii) identificar aquellas células en las que se produzca una disminución de la expresión del gen reportero en donde el compuesto es antitumoral si provoca una disminución de la expresión del gen reportero.

16. Un método según la reivindicación 15 en donde la variante de la secuencia SEQ ID NO: 1 cuya actividad transactivadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada comprende una sustitución del amino ácido en posición 193 en dicha secuencia por un análogo estructural de un fosfoamino ácido.

17. Un método según la reivindicación 16 en donde el análogo estructural de un fosfoamino ácido es Asp.

18. Un método según la reivindicación 15 en donde el polipéptido (i) comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.

19. Un método según la reivindicación 18 en donde la célula que se usa en la etapa (i) comprende, adicionalmente, un gen que codifica PKC-θ.

20. Un método según la reivindicación 19 en donde el gen que codifica PKC-θ se encuentra operativamente controlado por un promotor inducible.

21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 en donde el método se lleva a cabo mediante un ensayo de alta capacidad de procesamiento.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> CSIC

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE p300

<130> P3657ES01

<150> P200800295

<151> 2008-02-04

<150> ES200800295

<151> 2008-02-04

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 1

<210> 2

<211> 2414

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 2

<210> 3

<211> 512

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 3

<210> 4

<211> 512

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 4

OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. Ver Hoja Adicional

21 N.o solicitud: 201030004 22 Fecha de presentación de la solicitud: 05.01.2010 32 Fecha de prioridad:

DOCUMENTOS RELEVANTES

INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

No de solicitud: 201030004

CLASIFICACION OBJETO DE LA SOLICITUD

C07K14147 (01.01.2006) A61K38117 (01.01.2006) A01K671027 (01.01.2006) A61P37100 (01.01.2006)

Documentación minima buscada (sistema de clasificación seguido de los simbolos de clasificación)

C07K, A61K, A01K, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de busqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, PAJ, REGISTRY, HCAPLUS, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/4

OPINION ESCRITA

No de solicitud: 201030004

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.02.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones

La invención consiste en la variantes S193D de la SEQ ID no 1. La SEQ ID no 1 a su vez, es una proteina que corresponde a la secuenci.

19. 703 de la proteina p300. La variante S193D de la SEQ ID no1, tiene la actividad transactivadora de la transcripción constitutivamente activada, Esta variante se utiliza en la preparación de composiciones farmaceuticas para tratar enfermedades causadas por una inhibición de la actividad de las proteinas p300, NF-kB, NF-AT y/o c-jun.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 3/4

OPINION ESCRITA

No de solicitud: 201030004

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

El documento D01, describe la obtención del derivad.

19. 703 de la proteina p300. El documento D02, describe la secuencia de la proteina p300.

2. Declaración motivada segun los articulos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La variante de la SEQ ID no 1 en la que el aminoacido de la posición 193 es Asp, es nueva y tiene actividad inventiva Los documentos citados solo muestran el estado general de la tecnica y no se consideran de particular relevancia, ya que para una persona experta en la materia no seria obvio aplicar las caracteristicas de los documentos citados y llegar a la invención tal como se contempla en las reivindicaciones. Por tanto, el objeto de la presente solicitud, cumple los requisitos de novedad, actividad inventiva de acuerdo a los Art. 6 y 8 de la LP.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 4/4