Una composición que comprende proteína de clase bARE AB5, arginina y un derivado de colesterol con un ácido carboxílico.

Composiciones estabilizadas.

Campo técnico La presente invención se refiere a la estabilización de una proteína de clase exotoxina que ribosila ADP bacteriana (bARE) , un procedimiento para analizar una proteína de clase bARE, un procedimiento para la estabilización de la proteína bacteriana de clase bARE, composiciones que comprenden una proteína bARE estabilizada, composiciones que comprenden una proteína de clase bARE sustancialmente integral y formulaciones inmunogénicas que las incorporan.

Antecedentes

Una parte importante del desarrollo de un agente terapéutico proteico es la preparación de la proteína en una forma estabilizada que puede almacenarse durante periodos prolongados sin pérdida de actividad de modo que la dosis y actividad del agente terapéutico proteico pueda controlarse cuidadosamente.

Los polipéptidos pueden perder actividad biológica como resultado de inestabilidades físicas, incluyendo desnaturalización y formación de agregados solubles e insolubles, y una diversidad de inestabilidades químicas, tales como hidrólisis, oxidación y desamidación. La estabilidad de polipéptidos en formulaciones farmacéuticas líquidas puede verse afectada, por ejemplo, por factores tales como pH, fuerza iónica, temperatura, ciclos repetidos de congelación-descongelación, y exposición a fuerzas de cizallamiento mecánicas tales como las que se producen durante el procesamiento. La formación de agregados y pérdida de actividad biológica también puede producirse como resultado de agitación física e interacciones de moléculas polipeptídicas en solución y en las interfaces líquidoaire dentro de frascos de almacenamiento. Pueden producirse cambios conformacionales adicionales en polipéptidos adsorbidos en las interfaces aire-líquido y sólido-líquido durante la compresión-extensión de las interfaces que resultan de agitación durante el transporte o de otro modo. Dicha agitación puede provocar que la proteína se enmarañe, agregue, forme partículas y en última instancia precipite con otras proteínas adsorbidas. Para una revisión general de estabilidad de agentes farmacéuticos proteicos, véase, por ejemplo, Manning y col. (1989) Pharm. Res. 6: 903-918, y Wang y Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S14.

El desarrollo de agentes terapéuticos proteicos multiméricos presenta desafíos adicionales especialmente si la integridad de la proteína multimérica es esencial para la eficacia del producto final terapéutico. En tales casos, no solamente es necesario asegurar que la proteína se mantenga sin pérdida de actividad y sin precipitación o agregación proteica sino que también es importante comprobar si la integridad de la proteína multimérica se ha mantenido en el producto final terapéutico.

Hasta la fecha, los trabajadores en el campo de la estabilización de proteínas multiméricas, tales como proteínas de clase exotoxina ribosilantes de ADP bacterianas (bARE, incluyendo toxina del cólera (véase documento US 2002/0044 939) y enterotoxina lábil por calor de E. coli (véase Pronk y col., J. Biol. Chem. 260: 13508-4) que se organizan como multímeros A:B se han enfrentado con al menos dos tipos de problemas diferentes cuando trabajan con tales proteínas. En particular, las proteínas bARE pueden perder su actividad biológica: (i) como resultado de inestabilidades físicas incluyendo desnaturalización y formación de agregados solubles e insolubles; y/o (ii) por la disociación parcial o completa de la proteína bARE en sus formas subunitarias A y B.

En ocasiones puede ser fácil ver cuando una proteína, tal como una proteína multimérica precipita en una solución debido a que pueden formarse partículas cristalinas o agregados. Por otro lado, no es tan fácil determinar si una proteína multimérica se ha disociado parcial o completamente en sus formas subunitarias porque, por ejemplo, un ensayo proteico, no diferenciará entre formas intactas y disociadas de la proteína multimérica.

Hasta la fecha, no ha estado disponible información sobre como medir la integridad de multímeros proteicos de bARE sin pérdida de la estructura multimérica integral. Los métodos analíticos actuales usados para caracterizar proteínas de clase bARE muliméricas, incluyendo electroforesis, inmunotransferencia, espectrometría de masas y análisis de aminoácidos, son incapaces de distinguir entre la estructura multimérica integral y las formas sub unitarias disociadas separadas. Esta incapacidad de diferenciar entre proteínas bARE integrales y disociadas se debe al hecho de que las técnicas analíticas actuales requieren la disociación de las formas subunitarias A y B y por lo tanto no mantienen la organización estructural de la molécula bARE multimérica integral. Tampoco permiten estas técnicas la cuantificación de la molécula bARE integral en relación con la molécula subunitaria disociada. Por lo tanto, los procedimientos analíticos actuales no son útiles para estudiar la disociación (o pérdida de integridad) de la proteína bARE multimérica a lo largo del tiempo ni para buscar modos de estabilizar la proteína bARE multimérica. Además, incluso cuando se usan procedimientos de separación tradicionales, tales como procedimientos de filtración en gel, que no requieren la disociación en forma subunitarias monoméricas, estos procedimientos no son muy eficaces puesto que no permiten una buena resolución de las diferentes formas subunitarias debido a tiempos de retención extremadamente cercanos.

Como resultado, hasta la fecha, no ha estado disponible un procedimiento fiable para determinar si una muestra particular de una molécula bARE está presente o no en una forma intacta o disociada para los trabajadores en el campo de las moléculas bARE. Un procedimiento tal no sería útil solamente para: (i) distinguir entre la estructura bARE multimérica integral y subunidades A y B disociadas, separadas sino que también sería útil para (ii) investigar y determinar las condiciones requeridas para la estabilidad de una proteína de clase bARE incluyendo la identificación de agentes estabilizadores eficaces. Los procedimientos para evaluar, conseguir y cuantificar la estabilidad de proteínas de clase bARE serían muy útiles para (iii) el desarrollo de formulaciones apropiadas para proteínas de clase bARE para almacenamiento estable y suministro de la proteína bARE, sola o, por ejemplo, como parte de una composición, tal como una composición inmunogénica (por ejemplo, vacuna) .

Como se ha mencionado anteriormente, otro obstáculo principal que debe superarse en el uso de agentes farmacéuticos basados en proteínas, tales como los que incluyen una proteína bARE como un agente terapéutico es la pérdida de utilidad farmacéutica que puede resultar de su inestabilidad en formulaciones farmacéuticas. La estabilización de polipéptidos en composiciones farmacéuticas sigue siendo un área en el que la prueba y error desempeña un papel principal (revisado por Wang (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Wang y Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26) . Los excipientes que se añaden a formulaciones farmacéuticas polipeptídicas para aumentar su estabilidad incluyen tampones, azúcares, tensioactivos, aminoácidos, polietilenglicoles y polímeros, pero los efectos estabilizadores de estos aditivos químicos pueden variar dependiendo de la proteína. Las inestabilidades físicas que amenazan la actividad y eficacia polipeptídica en formulaciones farmacéuticas incluyen desnaturalización y formación de agregados solubles e insolubles. Se sabe que algunos de estos cambios conducen a la pérdida o reducción de la actividad farmacéutica de la proteína bARE de interés. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios se desconocen, pero los productos degradantes resultantes aún se consideran farmacéuticamente inaceptables debido al potencial de efectos secundarios indeseables.

La formación de agregados por un polipéptido tal como una molécula bARE durante el almacenamiento de una composición farmacéutica puede afectar de forma adversa a la actividad biológica de ese polipéptido, dando como resultado pérdida o reducción de la actividad farmacéutica o eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como bloqueo de los tubos, membranas o bombas cuando la estabilidad funcional de una proteína bARE se determina usando un sistema analítico, tal como un procedimiento cromatográfico o cuando la composición farmacéutica basada en proteína bARE se administra usando un sistema de infusión. Además, la inyección de una composición... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende proteína de clase bARE AB5, arginina y un derivado de colesterol con un ácido carboxílico.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la arginina está presente en una cantidad de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 400 mM.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que dicho derivado de colesterol está presente en una cantidad de aproximadamente 0, 05 % a aproximadamente 0, 5 % en peso por volumen (p/v) .

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho derivado de colesterol se selecciona de CHAPS (3- (3-colamidopropil) -dimetilamonio-1-propanosulfonato) y CHAPSO (3- (3colamidopropil) -dimetilamonio-2-hidroxi-propanosulfonato) .

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho derivado de colesterol es CHAPS.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la proteína AB5 es una proteína LTK63 o LTR72.

7. Un procedimiento para estabilizar una proteína bARE AB5 comprendiendo el procedimiento proporcionar una proteína bARE AB5 y combinar la proteína bARE AB5 con arginina y un derivado de colesterol con un ácido carboxílico.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho derivado de colesterol es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

9. El procedimiento de las reivindicaciones 7 u 8, en el que la proteína bARE AB5 es una proteína LTK63 o LTR72.

10. Un procedimiento para analizar una proteína de clase bARE AB5 en condiciones no disociativas que diferencia entre proteínas de clase bARE integrales y disociadas, caracterizado porque el procedimiento comprende una etapa de separación en un material de separación polimérico cargado, en el que el material de separación es un material de polimetacrilato hidroxilado (HEMA) con grupos carboxilo residuales.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el HEMA tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 6 micrómetros.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que HEMA tiene una porosidad de aproximadamente 250 A.

13. Un procedimiento para analizar una proteína de clase bARE AB5 comprendiendo el procedimiento:

(i) aplicar una proteína de clase bARE AB5 a un material de separación polimérico cargado en un aparato configurado para diferenciar una proteína de clase bARE AB5 integral de una proteína de clase bARE AB5 disociada, en el que el material de separación es un material de polimetacrilato hidroxilado (HEMA) con grupos carboxilo residuales;

(ii) tratar el material de separación que comprende la proteína de clase bARE AB5 aplicada con un tampón iónico; y

(iii) detectar una o más proteínas de clase bARE AB5 integrales o disociadas.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el material de separación es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 11-12.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en el que el tampón iónico es un tampón fisiológicamente aceptable con un pH de aproximadamente 7, 0 a aproximadamente 8, 0.

16. Un procedimiento para identificar un agente de estabilización de proteína de clase bARE AB5 comprendiendo el procedimiento:

(i) combinar un agente de estabilización de proteína de clase bARE AB5 para formar una muestra de proteína bARE AB5;

(ii) aplicar la muestra de proteína bARE AB5 a un material de separación polimérico cargado en un aparato configurado para diferenciar una proteína de clase bARE AB5 integral de una proteína de clase bARE AB5 disociada, en el que el material de separación es un material de polimetacrilato hidroxilado (HEMA) con grupos carboxilo residuales;

(iii) tratar el material de separación que comprende la proteína de clase bARE AB5 aplicada con un tampón iónico;

(iv) detectar una o más proteínas de clase bARE AB5 integrales o disociadas; y

(v) determinar si el agente estabilizador candidato es un agente estabilizador de proteína bARE AB5.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el procedimiento comprende calcular una Relación de Integridad para la muestra de proteína bARE AB5.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el procedimiento (adicionalmente) comprende comparar la relación de integridad para la muestra de proteína bARE AB5 con una relación de integridad para un control sin un agente estabilizador candidato.

19. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 16-18, en el que el material de separación es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 11-12.

20. Una composición inmunogénica que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

21. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende adicionalmente un adyuvante, en la que dicho adyuvante no es proteína bARE AB5.

22. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 21, en la que el adyuvante es un adyuvante de 15 mucosa.

23. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar un trastorno inmune.

24. Uso de una combinación de Arginina y un derivado de colesterol con un ácido carboxílico, para estabilizar físicamente una proteína bARE AB5.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el derivado es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

26. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

2. 25, en el que la proteína bARE AB5 es una proteína LTK63 o LTR72.

Figura.

2. 2D

Figura 5C Figura 5D

K63 B5

15, 07

65.607

Superposición de proteínas patrón, referencia CRM197 (azul en negrita) , K63 (azul en negrita) , una curva de calibración usada para determinación de PM aparente.

PM LTK63 en fosfato 20 mM, CHAPS 0, 1 % sobrenadante T3 LTK63 en fosfato 20 mM, CHAPS 0, 1 % sedimento T3 LTK63 en fosfato 20 mM, CHAPS 0, 25 % sobrenadante T3 LTK63 en fosfato 20 mM, CHAPS 0, 25 % sedimento T3 LTK63 en fosfato 20 mM, CHAPS 0, 5 % sobrenadante T3 LTK63 en fosfato 20 mM, CHAPS 0, 5 % sedimento T3 PM LTK63 2 mg/ml en fosfato 20 mM, L-arginina 100 mM sobrenadante T1 LTK63 2 mg/ml en fosfato 20 mM, L-arginina 100 mM sedimento T1 LTK63 4 mg/ml en fosfato 20 mM, L-arginina 100 mM sobrenadante T1 LTK63 4 mg/ml en fosfato 20 mM, L-arginina 100 mM sedimento T1

Los pesos moleculares medios se proporcionan para detergentes compuestos de mezclas de longitudes de cadena; b. Temperatura.

20. 25 º Ca.

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