Composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina.

Una composición que comprende

al menos un agente farmacológicamente activo que tiene un efecto farmacológico detectable sobre una célula o unorganismo,

acoplado a un componente específico de célula diana que se une de forma específica a una célula diana,yal menos una saponina, seleccionándose dicha saponina entre el grupo que comprende las saponinas triterpenoidescon estructuras básicas que pertenecen al tipo del 12,13-dehidrooleanano con una función aldehído en posición 23,en la que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es unatoxina quimérica o un conjugado de toxina, siendo dicha toxina quimérica o conjugado de toxina una proteínarecombinante sencilla,

en la que dicho agente farmacológicamente activo no es una saponina, y no es una proteína de unión a antígenoque comprende una región de unión al antígeno y una región o regiones de un anticuerpo que media o medianprocedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos, tales como citotoxicidad celular dependiente deanticuerpos, activación del complemento, opsonización y fagocitosis, en la que dicho componente específico decélula diana se selecciona entre el grupo que comprende (a) proteínas, tales como proteínas naturales, proteínasrecombinantes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos proteicos y lipoproteicos, tales como factores decrecimiento como por ejemplo EGF, GM-CSF, VEGF, TGF y quimeras de los mismos, citoquinas como por ejemplointerleucinas, interferones, transferrina, moléculas de adhesión como por ejemplo CD4 y activador de plasminógenode tipo uroquinasa, (b) péptidos, tales como péptidos naturales y péptidos sintéticos, (c) hormonas y lascombinaciones de (a) - (c), y en la que dicha célula diana se selecciona entre el grupo que comprende célulascancerosas, y en la que dicho agente farmacológicamente activo es una citotoxina que se selecciona entre el grupoque comprende (a) proteínas vegetales tóxicas, tales como proteínas inactivadora de ribosomas (RIP), en particularproteínas de tipo I como por ejemplo saporina, diantina, gelonina, PAP y fragmentos enzimáticamente activos de lasmismas y la cadena A de proteínas de tipo II como por ejemplo de ricina, abrina, lecitina de muérdago (viscumina), ymodecina, pero sin excluir otros fragmentos o proteínas de tipo II de longitud completa, (b) proteínas y péptidosfúngicos tóxicos, tales como α-sarcina o mitogilina, (c) toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria o laexotoxina de Pseudomonas, y (d) proteínas animales tóxicas, tales como angiogenina o granzima B, en particular deorigen humano.

Composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina La presente invención se refiere a una composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina de acuerdo con la reivindicación 1, a los usos de dicha composición y a un kit que comprende dicha composición.

El uso de un tratamiento médico que usa un agente farmacológicamente activo, en numerosos ejemplos, depende de la capacidad de suministrar tal agente farmacológicamente activo en su sitio de acción previsto. Sin embargo, con bastante frecuencia, no se pueden conseguir concentraciones suficientemente elevadas del agente farmacológicamente activo en el sitio de acción previsto, en primer lugar debido a que el agente farmacológicamente activo nunca alcanza el sitio o bien a que es metabolizado con demasiada rapidez para que sea capaz de ejercer su acción. En el pasado, una forma de aproximarse a este problema ha sido combinar el agente farmacológicamente activo con un componente diana específico de modo que aumentara la probabilidad de que el agente alcanzarla diana. Esta aproximación se ha adoptado, por ejemplo, en el caso de las inmunotoxinas. En el sentido más amplio, las inmunotoxinas (ITs) son proteínas quiméricas o conjugados acoplados químicamente en los que un resto dirigido a una célula se combina con un agente citotóxico. Este último es una molécula radiactiva pequeña, un compuesto orgánico de bajo peso molecular o el dominio catalítico de una toxina natural. El resto dirigido a la célula es normalmente un fragmento de anticuerpo o un ligando natural para antígenos de superficie endocíticos asociados al cáncer. Los antígenos diana típicos son el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el receptor del protooncogen ErbB2 (también conocido como HER-2 en los seres humanos) , el receptor de interleucina-2 o hidratos de carbono asociados al cáncer (1) .

La primera inmunotoxina (IT) recombinante aprobada por la Agencia de Alimentos y Medicamentos Americana fue Ontak. Esta consiste en interleucina-2 y partes de la toxina de la difteria. Se desarrolló para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T (2, 3) . Además del Ontak se han aprobado otras dos ITs acopladas químicamente, Zevalin (4, 5) y Mylotarg (6) , y se encuentran en investigación varias ITs en fase de ensayos clínicos.

A pesar del éxito clínico de varias ITs desarrolladas recientemente, la captación citosólica eficaz del fármaco continúa siendo el problema principal que requiere la aplicación de grandes dosis totales para conseguir las elevadas concentraciones locales necesarias. Esto a menudo conduce a toxicidad no específica, que a menudo da como resultado en daño endotelial difuso y el síndrome de fuga vascular concomitante (revisado en (7) ) . Una mejora para las ITs recombinantes fue el desarrollo de un adaptador molecular que une el tóxico y el resto dirigido. Debido a la escisión endosómica y citosólica de péptidos, el adaptador media en la captura citosólica de la toxina (8) que conduce a una reducción de los efectos secundarios sobre células no diana in vitro (9) .

En algunas inmunotoxinas la secuencia natural de translocación de membrana de la toxina se usa para mediar la transferencia de membrana endosómica. Mientras esto es posible, por ejemplo, para la toxina de la difteria y la exotoxina de Pseudomonas, otras toxinas como las proteínas inactivadoras de los ribosomas (RIP) de tipo I de plantas, que carecen de una secuencia de translocación, deben entrar en las células usando otros mecanismos que son desconocidos hasta la fecha. En la última década, el uso de dominios de transducción de proteínas (PTD, a los que también se hace referencia como péptidos troyanos o proteínas permeables a células) capaces de transportar moléculas efectoras a las células se ha convertido en un mecanismo con cada vez mayor atractivo para solventar este problema (revisado en (10, 11) ) . Se han identificado diversos péptidos vectores derivados de proteínas virales, bacterianas, de insectos y de mamíferos que poseen propiedades de transducción de membrana y se han realizado ensayos para determinar su capacidad para suministrar compuestos, proteínas y ADN. En todos estos experimentos, sin embargo, la captación mediada por PTD fue inespecífica y por lo tanto independiente del tipo celular y de los receptores celulares de superficie. Para solventar este problema se unió un PTD en las denominadas toxinas inmunoadaptadoras a través de un péptido de escisión endosómica a un resto específico de célula diana. El PTD no se expone hasta la unión de la toxina inmunoadaptadora con el receptor de una diana celular específica, internalización y escisión endosómica (9) . No obstante, la captación citosólica de estas ITs mejoradas es claramente inferior que la de las potentes toxinas naturales.

La absorción insuficiente del fármaco debido a una inadecuada transferencia de membrana desde el lumen de los compartimentos intracelulares hasta el citosol es un problema general de las ITs. Después de unirse a un receptor endocítico y la posterior internalización, la mayoría de las ITs se dirigen a los lisosomas para su degradación o se reciclan de nuevo a la superficie celular (12) . La captación citosólica de compuestos orgánicos pequeños como 5fluorouridina se puede potenciar por acoplamiento del fármaco a través de un enlace de hidrazona escindible por ácidos a un anticuerpo o ligando específico de la célula diana (13) . Después de la internalización, el fármaco se libera en el interior de los endosomas por hidrólisis ácida y se difunde pasivamente al citosol. Esta técnica, sin embargo, permite que el fármaco, una vez liberado, se introduzca en otras células de forma no específica y no es apropiada para grandes fármacos como las toxinas proteicas. Las ITs tales como BL22 u Ontak dependen del dominio de translocación de la toxina natural para una captación eficaz (14) . Esto limita el número de toxinas naturales disponibles para la construcción de ITs. Para mejorar la captación de toxinas que no poseen un dominio de translocación como la cadena A de la toxina de la difteria, la cadena A de la toxina del ricino, la saporina-3 RIP de

tipo 1 o proteínas humanas tóxicas, se sugirió la introducción de péptidos permeables a membranas, denominados dominios de transducción de proteínas (PTD) o péptidos troyanos (8) . Aunque los dominios de transducción de proteínas (PTDs) mostraron ser activos en numerosos estudios que tratan de la importación de proteínas inespecíficas, el intento de potenciar la citotoxicidad de las inmunotoxinas no tuvo éxito (9, 15) . Sin embargo, la inserción de péptidos escindibles flanqueando el PTD ha mostrado que reduce los efectos secundarios en las células no diana (9) . Los esfuerzos para aumentar la especificidad hacia las células diana están acompañados normalmente por una pérdida concomitante en el potencial citotóxico en comparación con la toxina nativa. La eficacia de la toxina natural de la difteria, que dependiendo de la línea celular diana tiene valores de CI50 de 10 a 100 pM (8) , no se ha alcanzado hasta la fecha.

Hebestreit y Melzig (29) mostraron que la saponina agrostenumasaponina 1 potencia la citotoxicidad de la proteína inactivadora de los ribosomas agrostina a pesar de la inhibición concomitante de la unión del resto de agrostina a los hidratos de carbono de la superficie celular usando diversos monosacáridos. Por lo tanto, la agrostenumasaponina 1 es capaz de potenciar el transporte de agrostina a través de la membrana celular (posiblemente mediante la formación de estructuras similares a poros dentro de la bicapa de fosfolípidos) independientemente del reconocimiento y unión de células a través del resto de agrostina dirigido a la célula. Por lo tanto, la dirección hacia células específicas, por ejemplo células cancerosas, no es posible.

Por lo tanto fue un objetivo de la presente invención proporcionar una composición en la que se aumente la función específica de un agente farmacológicamente activo, en particular la citotoxicidad de una toxina quimérica o un conjugado de toxina, sobre células diana. Además fue un objetivo de la presente invención reducir los efectos secundarios asociados al uso de agentes farmacológicamente activos, por ejemplo durante terapia tumoral. Además fue un objetivo de la presente invención proporcionar formas para que la cantidad de los agentes farmacológicamente activos que se usan y administran en una terapia se pueda reducir considerablemente.

Todos estos objetivos se alcanzaron mediante una composición que comprende al menos un agente farmacológicamente... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende al menos un agente farmacológicamente activo que tiene un efecto farmacológico detectable sobre una célula o un organismo, acoplado a un componente específico de célula diana que se une de forma específica a una célula diana, y al menos una saponina, seleccionándose dicha saponina entre el grupo que comprende las saponinas triterpenoides con estructuras básicas que pertenecen al tipo del 12, 13-dehidrooleanano con una función aldehído en posición 23, en la que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es una toxina quimérica o un conjugado de toxina, siendo dicha toxina quimérica o conjugado de toxina una proteína recombinante sencilla, en la que dicho agente farmacológicamente activo no es una saponina, y no es una proteína de unión a antígeno que comprende una región de unión al antígeno y una región o regiones de un anticuerpo que media o median procedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, activación del complemento, opsonización y fagocitosis, en la que dicho componente específico de célula diana se selecciona entre el grupo que comprende (a) proteínas, tales como proteínas naturales, proteínas recombinantes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos proteicos y lipoproteicos, tales como factores de crecimiento como por ejemplo EGF, GM-CSF, VEGF, TGF y quimeras de los mismos, citoquinas como por ejemplo interleucinas, interferones, transferrina, moléculas de adhesión como por ejemplo CD4 y activador de plasminógeno de tipo uroquinasa, (b) péptidos, tales como péptidos naturales y péptidos sintéticos, (c) hormonas y las combinaciones de (a) - (c) , y en la que dicha célula diana se selecciona entre el grupo que comprende células cancerosas, y en la que dicho agente farmacológicamente activo es una citotoxina que se selecciona entre el grupo que comprende (a) proteínas vegetales tóxicas, tales como proteínas inactivadora de ribosomas (RIP) , en particular proteínas de tipo I como por ejemplo saporina, diantina, gelonina, PAP y fragmentos enzimáticamente activos de las mismas y la cadena A de proteínas de tipo II como por ejemplo de ricina, abrina, lecitina de muérdago (viscumina) , y modecina, pero sin excluir otros fragmentos o proteínas de tipo II de longitud completa, (b) proteínas y péptidos fúngicos tóxicos, tales como a-sarcina o mitogilina, (c) toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria o la exotoxina de Pseudomonas, y (d) proteínas animales tóxicas, tales como angiogenina o granzima B, en particular de origen humano.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque, en dicha toxina quimérica o conjugado de toxina, dicho agente farmacológicamente activo se acopla a dicho componente específico de célula diana a través de una unión covalente.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicho componente específico de célula diana es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o un factor de crecimiento, citoquina o transferrina o una combinación de cualquiera de estos.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha saponina es Saponinum album de Gypsophila paniculata.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha composición comprende adicionalmente al menos una de las siguientes unidades funcionales: una proteína de transporte capaz de transportar dicho agente farmacológicamente activo al interior de una célula, un enlace de escisión citosólica y un enlace de escisión endosómica.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque dicho agente farmacológicamente activo se acopla a dicho componente específico de célula diana a través de dicha proteína de transporte, enlace de escisión citosólica y/o enlace de escisión endosómica.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

5. 6, caracterizada porque dicha proteína de transporte es un dominio transducción de proteínas (PTD) , dicho enlace de escisión citosólica es parte de un péptido y dicho enlace de escisión endosómica es parte de un péptido.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento.

9. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad seleccionada entre el grupo que comprende enfermedades cancerosas.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque dicha saponina se debe administrar por separado de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

9. 10, caracterizado porque dicha saponina se debe administrar a través de una vía diferente a la vía de administración de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicha saponina se debe administrar a través de inyección y dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana se administra a través de ingestión o viceversa.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

9. 10, caracterizado porque dicha saponina se debe

administrar a través de la misma vía que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicha administración se produce a través de inyección.

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

9. 15, caracterizado porque dicha saponina se debe

administrar antes que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

16. Un kit que comprende, en uno o más envases, dicha composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8.

17. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicho agente farmacológicamente activo acoplado 15 a dicho componente específico de célula diana y dicha saponina están en envases separados.