Secuencia polinucleotídica para la inhibición de la síntesis de fosfolambano.

Secuencia polinucletídica de ADN que comprende

a. un primer elemento de secuencia que,

cuando se transcribe por una ARN polimerasa, conduce a la transcripción de un ARNip basado en microARN (miARNip) y da lugar a un transcrito capaz de formar una estructura de horquilla parcialmente autocomplementaria que puede procesarse por una célula de mamífero hasta un producto de ARNip capaz de degradar un ARNm en dicha célula, en el que el ARNm degradado por el producto de ARNip codifica fosfolambano,

b. una secuencia promotora ligada operativamente al primer elemento de secuencia, siendo operativa dicha secuencia promotora por una ARN polimerasa de origen natural en una célula de mamífero, en la que la secuencia promotora es un promotor específico de célula de cardiomiocito, y

c. una secuencia de empaquetamiento polinucleotídico de ADN derivado de virus;

caracterizada porque el miARNip comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 002 o SEQ ID NO 003.

Secuencia polinucleotídica para la inhibición de la síntesis de fosfolambano La presente invención se refiere a reactivos que facilitan la inhibición de fosfolambano en tejido cardíaco de animales superiores. Más específicamente, la invención se refiere a secuencias polinucleotídicas capaces de regular 5 negativamente la expresión de fosfolambano en una célula de paciente, como se especifica en las reivindicaciones independientes.

La insuficiencia cardíaca y la insuficiencia cardíaca congestiva son patologías de gran importancia. Están asociadas a deficiencias en la contractilidad cardíaca y anormalidades en el tráfico de calcio intracelular.

El fosfolambano (PLB) es una proteína de membrana integral de 52 aminoácidos que forma parte en la regulación de la bomba de ión de calcio en células musculares. En células musculares cardíacas, el PLB controla la bomba de ATPasa de Ca2+ del retículo sarcoendoplásmico (SERCA) . La relación de PLB/SERCA influye en la contractilidad cardíaca. La expresión aumentada de SERCA y la inhibición de PLB funcionan ambas hacia una contractilidad mejorada en cardiomiocitos deteriorados. El ARNm (cds) del fosfolambano está publicado en la base de datos nucleotídica del National Center of Biotechnology Information (NCBI) como NM_002667.2.

Se ha mostrado que la sobreexpresión de SERCA puede restaurar la contractilidad, el tráfico de calcio y la respuesta de frecuencia en cardiomiocitos aislados (Del Monte et al., Circulation 1999, 100: 2308-2311) .

Son posibles diferentes enfoques para la regulación negativa de la actividad de PLB en una célula. El documento US2004121942A1, por ejemplo, emplea la expresión de proteína PLB mutada exógena para alcanzar este efecto.

Es otro enfoque el uso de ácido ribonucleico (ARN) tal como anticodificante o ARNip para suprimir la expresión 20 génica al nivel de control de ARNm.

Esto se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/080985, que da a conocer varias moléculas de ARNip correspondientes a una porción de la secuencia de ácido nucleico de fosfolambano, que son capaces de inhibir la expresión de fosfolambano en una célula. Este documento menciona también que podría ser posible usar un vector de expresión que comprende ADN que codifica dicho ARNip, en el que el vector puede ser un vector adenovírico.

Puesto que el ARN no es una molécula estable que se preste fácilmente a formulación y uso farmacéutico, la aplicación directa de moléculas de ARN no es necesariamente el enfoque clínico más prometedor para aplicar ARN a la gestión de enfermedades humanas. Es un enfoque que elude la inestabilidad del ARN el uso de ribonucleótidos químicamente modificados, tales como moléculas de esqueleto de tiofosfato o restos de 2’-desoxipurina o 2’-Ometilpirimidina. Enfoques comparables durante la época anticodificante han padecido problemas de toxicidad

causados por las moléculas y sus productos de degradación.

Es un enfoque alternativo que evita la aplicación de moléculas de ARN transcribir el ARN en la célula del paciente a partir de módulos de expresión de ácido desoxirribonucleico (ADN) . El ADN es más estable en muchas condiciones encontradas en el suministro de fármacos, y son conocidas diferentes tecnologías para suministrar módulos de expresión de ADN a las células de pacientes. Estas incluyen transferencia vírica, bombardeo de células mediado por

partículas, inyección de ADN desnudo o ADN complejado con policationes o liposomas en el tejido, y otros procedimientos conocidos en el contexto de la denominada “terapia génica”.

Se ha intentado restaurar la contractilidad de células de músculo cardíaco deterioradas in vitro mediante la inhibición de la expresión de PLB con moléculas de ARN anticodificantes expresadas a partir de vectores adenovíricos en cardiomiocitos cultivados (Eizema et al., Circulation 2000; 101; 2193-2199; y Del Monte et al., Circulation 2002; 105;

904-907) .

Diferentes enzimas transcriben ARN a partir de ADN en una célula eucariótica, específicamente la ARN polimerasa I, II y III. La transcripción de cada polimerasa está controlada por diferentes elementos reguladores que regulan la expresión del gen asociado. Tradicionalmente, la expresión de moléculas cortas no de ARNm a partir de módulos de expresión introducidos artificialmente en células ha hecho uso de la ARN polimerasa III (Pol-III) . La Pol-III sintetiza 45 ARN ribosómico de 5S y ARNt. La actividad de ARN Pol-III no está controlada de forma específica de célula. El documento US2005064489 describe promotores de Pol-III regulados por el sistema transactivador de tetraciclina. Dichos promotores condicionalmente activos ofrecen la ventaja de ser capaces de controlar el estado de actividad del transgén introducido artificialmente en un paciente; sin embargo, no ofrecen especificidad celular si se aplican al cuerpo entero de un paciente por suministro sistémico.

En cualquier enfoque clínico que intente regular la expresión génica, la especificidad celular o tisular es un elemento altamente deseable de control y seguridad. Por ello, serían ventajosos medios para facilitar la expresión de ARN orientado a PLB a partir de promotores específicos de célula tales como promotores de ARN polimerasa II para el control de la expresión de fosfolambano en células cardíacas.

Se ha intentado la regulación anticodificante de PLB por promotores de Pol-II expresando ARN anticodificante bajo el control del promotor de CMV o del factor natriurético auricular inducible (ANF) (Eizema et al., Circulation 2000; 101; 2193-2199) .

Los intentos de regular negativamente la expresión de proteínas intracelulares mediante enfoques anticodificantes no han conseguido generalmente el éxito clínico esperado por la tecnología en el momento de su implantación. Es un nuevo enfoque para regular negativamente la expresión génica intracelular el uso de las denominadas moléculas de ARN interferente pequeño (ARNip) . Estas son pares de moléculas de ARN bicatenario pequeñas de típicamente 19-29 pares de bases de longitud, una de cuyas hebras es complementaria de una sección del ARNm. El ARNm diana se degrada por el complejo RISC. Las moléculas de ARNip se descubrieron originalmente en plantas (Hamilton y Baulcombe, Science. 29 de oct. de 1999; 286 (5441) : 886) , y después en células de mamífero (Elbashir et al., Nature. 24 de mayo de 2001; 411 (6836) : 428-9, WO0244321) .

Está estrechamente relacionado el descubrimiento de microARN o miARN. Estas son moléculas de ARN sintetizadas naturalmente a partir de genes codificados genómicamente que, tras procesamiento por actividades modificadoras del ARN celular, dan lugar a estructuras de horquilla de ARN corta con estructuras de tallo de 11 pb

(pares de bases) . El miARN se orienta también a ARNm para degradación y es probablemente un mecanismo de control de la expresión génica en la célula.

El documento US26198825A1 muestra secuencias de ARNip que se sugiere que se orientan a la síntesis de fosfolambano.

Es un enfoque de la generación de ARNip in vivo la generación del denominado ARN de horquilla pequeño (ARNhp) ,

que es un precursor natural del ARNip. Dichas moléculas de ARNhp pueden generarse mediante la expresión de una molécula de ARN parcialmente autocomplementaria a partir de un módulo de expresión introducido en una célula eucariótica. La tecnología se revisa por McIntyre y Fanning (BMC Biotechnol. 2006; 6: 1) .

Los inventores han publicado recientemente los resultados de un experimento in vitro en los que se reducen ARNm de PLB y proteína, y se aumenta la captación de Ca, en cardiomiocitos de rata recién nacida primarios cultivados por

ARNhp expresado a partir de constructos adenovíricos activados por promotor de polimerasa III (Fechner et al., Gene Therapy 2007, 14, 211-218) .

Existen obstáculos técnicos adicionales para expresar ARNhp a partir de promotores de Pol-II. Este problema ha conducido recientemente al desarrollo de los denominados vectores generadores de miARNip (ARNip basados en microARN) que pueden usarse para activar la generación de ARNip a partir de un promotor de Pol-II (Shin et al., 30 Proc. Nat. Acad. USA 103, 13759-13764) . El miARNip puede describirse como una secuencia de ARNhp embebida entre secuencias flanqueantes de microARN particulares. Esta tecnología se ha puesto recientemente a disposición por Invitrogen Inc. como el plásmido pcDNA6.2-GW/miR. Este plásmido comprende el promotor de CMV (promotor temprano inmediato de citomegalovirus) como elemento de expresión de Pol-II. El promotor de CMV activa la transcripción de polimerasa II de forma constitutiva... [Seguir leyendo]

1. Secuencia polinucletídica de ADN que comprende a. un primer elemento de secuencia que, cuando se transcribe por una ARN polimerasa, conduce a la transcripción de un ARNip basado en microARN (miARNip) y da lugar a un transcrito capaz de formar una estructura de horquilla parcialmente autocomplementaria que puede procesarse por una célula de mamífero hasta un producto de ARNip capaz de degradar un ARNm en dicha célula, en el que el ARNm degradado por el producto de ARNip codifica fosfolambano,

b. una secuencia promotora ligada operativamente al primer elemento de secuencia, siendo operativa dicha secuencia promotora por una ARN polimerasa de origen natural en una célula de mamífero, en la que la 10 secuencia promotora es un promotor específico de célula de cardiomiocito, y

c. una secuencia de empaquetamiento polinucleotídico de ADN derivado de virus;

caracterizada porque el miARNip comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 002 o SEQ ID NO 003.

2. Secuencia polinucleotídica de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia promotora 15 específica de célula cardiomiocito es un promotor de ARN polimerasa II.

3. Secuencia polinucleotídica de ADN según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el promotor específico de célula cardiomiocito es al menos una de las secuencias SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 008 o SEQ ID NO 009.

4. Secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque

el primer elemento de secuencia comprende adicionalmente elementos de secuencia que facilitan el procesamiento 20 del transcrito por el aparato de corte y empalme de la célula.

5. Secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos una de las secuencias SEQ ID NO 004 y SEQ ID NO 005 y al menos una de las secuencias SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 008 o SEQ ID NO 009.

6. Una secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada

porque la secuencia polinucleotídica de ADN derivado de virus es una secuencia de empaquetamiento de adenovirus.

7. Una secuencia polinucleotídica de ADN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia polinucleotídica de ADN derivado de virus deriva de un virus adenoasociado.

8. Una secuencia polinucleotídica de ADN según la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia 30 polinucleotídica de ADN derivado de virus deriva de un virus adenoasociado de tipo 9.

9. La secuencia polinucleotídica de ADN de SEQ ID NO 010 o SEQ ID NO 011 o SEQ ID NO 012.

10. Una partícula vírica que contiene una secuencia polinucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. Una célula eucariótica aislada que contiene una secuencia polinucleotídica según cualquiera de las 35 reivindicaciones 1 a 9.

12. Una célula eucariótica aislada según la reivindicación 11, en la que la célula es una célula de mamífero.

13. Una composición para su uso en el tratamiento de cardiomiopatía que comprende:

a. una secuencia polinucleotídica, una partícula vírica y/o una célula de mamífero aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 40 b. un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición para su uso en el tratamiento de cardiomiopatía que comprende:

c. una secuencia polinucleotídica o una partícula vírica o una célula de mamífero aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y

d. una secuencia polinucleotídica de ADN o una partícula vírica que comprende un módulo de expresión que

comprende una segunda secuencia promotora operativa en un cardiomiocito y un segundo elemento de secuencia que codifica SERCA (Ca2+ -ATPasa de retículo sarcoendoplásmico) ligado operativamente con dicha segunda secuencia promotora, y

e. un excipiente farmacéuticamente aceptable.