Variantes de eritropoyetina.

Un polinucleótido que codifica una variante de eritropoyetina (EPO) seleccionado del grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican la forma madura de los polipéptidos denominados hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1- 1, h2-1, mS, mG3, mG5, m301, mK3, ha, hAma, hAmE y hA-10 que tienen la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 50, 51, 52, y 53,

respectivamente;

(b) un polinucleótido que codifica la forma madura del polipéptido denominado secuencia ha sin líder que consiste en la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 61;

(c) polinucleótidos que tienen la secuencia codificante, como se muestra en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57 y 58 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

(d) un polinucleótido que consiste en la secuencia codificante, como se muestra en SEQ ID NO: 60 que codifica la forma madura del polipéptido denominado secuencia ha sin líder;

(e) polinucleótidos que codifican una versión humanizada de los polipéptidos mS, mG3, mG5, m301 y mK3 que consisten en la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, y 22;

(f) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una fusión de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 24, 26, 28 y 30, en el extremo N de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 32, 34, 36 y 38, en donde dicha fusión tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora, pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(g) polinucleótidos que comprenden una fusión de secuencias polinucleotídicas seleccionadas del grupo de secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID NO: 23, 25, 27 y 29, en 5' de una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID: 31, 33, 35 y 37, en donde dicha fusión tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(h) polinucleótidos que codifican un derivado de un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de (a) a (g), en donde en dicho derivado entre 1 y 10 residuos de aminoácidos están conservadoramente sustituidos comparado con dicho polipéptido, y dicho derivado tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(i) polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido n codificado por un polinucleótido de cualquiera de (a) a (h), en donde en dicho fragmento entre 1 y 10 aminoácidos se delecionan N- y/o Cterminalmente y/o entre 1 y 10 aminoácidos se delecionan N- y/o C-terminalmente de la unión comparado con dicho polipéptido, y dicho fragmento tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(j) polinucleótidos que son al menos el 95% idénticos a un polinucleótido como se ha definido en cualquiera de (a) a (d) y que al mismo tiempo tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(k) polinucleótidos cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido como se ha definido en cualquiera de (a) a (j) y que codifica un polipéptido que tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(l) polinucleótidos que codifican un polipéptido variante de EPO, que comprende una parte N-terminal de EPO de longitud completa que incluye la hélice A y que carece al menos de uno de los siguientes:

(i) un fragmento de al menos 10 aminoácidos entre la hélice A y la hélice B;

(ii) un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la hélice B;

(iii) un fragmento de al menos 6 aminoácidos entre la hélice B y la hélice C;

(iv) un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la hélice C;

(v) un fragmento de al menos 20 aminoácidos entre la hélice C y la hélice D; y/o

(vi) un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la hélice D;

en donde dicha variante tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(m) polinucleótidos que codifican un derivado de un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de (l), en donde en dicho derivado entre 1 y 10 residuos de aminoácidos están conservadoramente sustituidos comparados con dicho polipéptido, y dicho derivado tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(n) polinucleótidos cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas con polinucleótidos como se han definido en cualquiera de (l) a (m) y que codifican un polipéptido que tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética; o la hebra complementaria de tal polinucleótido.

Variantes de eritropoyetina Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevas variantes endógenas de eritropoyetina (EPO) y su uso para el tratamiento o la prevención de una afección asociada con daño tisular debido a muerte celular (apoptosis, necrosis) e inflamación, en particular, para neuroprotección, por ejemplo, tratamiento de enfermedades agudas (por ejemplo, ictus) o crónicas (por ejemplo, ELA) del sistema nervioso.

Antecedentes de la invención El ictus es una enfermedad debilitante que afecta a más de 400.000 personas al año en los Estados Unidos y es la tercera causa más común de muerte en los Estados Unidos. Además la mitad de los pacientes hospitalizados de neurología tienen problemas relacionados con ictus. Con las tendencias actuales, se proyecta que este número salte a un millón al año en el año 2050. Cuando se consideran juntos los costes directos (cuidados y tratamiento) y los costes indirectos (productividad perdida) de los ictus, los ictus ponen una carga de 43, 3 mil millones de dólares al año en la sociedad de los Estados Unidos solo. Aproximadamente 1/3 de los pacientes mueren en los primeros tres meses, 1/3 permanecen con discapacidades graves, y solo 1/3 se recuperan con desenlace aceptable. En 1990 las enfermedades cardiovasculares eran la segunda causa principal de muerte en el mundo, matando más de 4, 3 millones de personas en el mundo. Por tanto, desde una perspectiva de salud pública, el ictus es una de las enfermedades más relevantes.

El ictus se caracteriza por la pérdida repentina de circulación a un área del cerebro, lo que produce una pérdida correspondiente de función neurológica. También llamado accidente cerebrovascular o síndrome de ictus, ictus es un término no específico que abarca un grupo heterogéneo de causas patofisiológicas, incluyendo trombosis, embolia y hemorragia. Los ictus actualmente se clasifican como hemorrágicos o isquémicos. Ictus isquémico agudo se refiere a ictus causados por trombosis o embolia y representan el 80% de los ictus.

Los ictus isquémicos resultan del bloqueo de las arterias que suministran al cerebro, más comúnmente en las ramas de las arterias carótidas internas. El bloqueo habitualmente se produce cuando una parte de un coágulo sanguíneo (trombo) o de un depósito de grasa (ateroma) debido a ateroesclerosis se rompe (convirtiéndose en un émbolo) , viaja a través del torrente sanguíneo, y se aloja en una arteria que suministra al cerebro. Los coágulos sanguíneos se pueden formar cuando un depósito de grasa en la pared de una arteria se rompe. La rotura de tal depósito de grasa también se puede formar cuando un gran depósito de grasa ralentiza el flujo sanguíneo, reduciéndolo a un hilo. La sangre que fluye lentamente es más probable que se coagule. Por tanto, el riesgo de que se forme un coágulo en y bloquee una arteria estrechada es alto. Los coágulos sanguíneos también se pueden formar en otras áreas, tal como en el corazón o en una válvula del corazón. Los ictus debidos a tales coágulos sanguíneos son los más comunes entre personas que han tenido recientemente cirugía cardiaca y personas que tienen un trastorno en una válvula del corazón o un ritmo cardiaco anormal (arritmia) , especialmente fibrilación auricular. Además, en ciertos trastornos tal como un exceso de glóbulos rojos (policitemia) , el riesgo de coágulos sanguíneos aumenta porque la sangre se espesa.

Un ictus isquémico también se puede producir, si el flujo sanguíneo al cerebro se reduce, como puede ocurrir cuando una persona pierde mucha sangre o tiene una presión sanguínea baja. Ocasionalmente, un ictus isquémico se produce cuando el flujo sanguíneo al cerebro es normal pero la sangre no contiene suficiente oxígeno. Los trastornos que reducen el contenido de oxígeno de la sangre incluyen anemia grave (una deficiencia en glóbulos rojos) , asfixia e intoxicación por monóxido de carbono. Habitualmente, el daño cerebral en tales casos está extendido (difuso) , y se produce coma. Un ictus isquémico se puede producir si la inflamación o infección estrecha los vasos sanguíneos que suministran al cerebro. De forma similar, fármacos tales como cocaína o anfetaminas pueden producir espasmo de las arterias, que puede producir un estrechamiento de las arterias que suministran al cerebro a tal grado que se produzca un ictus.

El cerebro requiere glucosa y oxígeno para mantener el metabolismo y la función neuronales. La administración inadecuada de oxígeno al cerebro produce una hipoxia y se produce isquemia del insuficiente flujo sanguíneo cerebral. Las consecuencias de la isquemia cerebral dependen del grado y la duración de flujo sanguíneo cerebral reducido. Las neuronas pueden tolerar la isquemia durante 30-60 minutos. Si el flujo no se restablece en el área isquémica, suceden una serie de procesos metabólicos. Las neuronas se vuelven deficientes en ATP y cambian a la glucólisis anaerobia, una ruta mucho menos eficaz. El lactato se acumula y el pH intracelular disminuye. Sin un suministro adecuado de ATP, las bombas iónicas en la membrana plasmática fallan. El flujo entrante resultante de sodio, agua, y calcio a la célula produce un rápido hinchamiento de las neuronas y células de glía. La despolarización de la membrana también estimula la liberación masiva de los aminoácidos glutamato y aspartato, que actúan ambos como neurotransmisores excitantes en el cerebro. El glutamato activa además los canales iónicos de sodio y calcio en la membrana de la célula neuronal, es decir el canal de calcio de N-metil-D-aspartato (NMDA) bien caracterizado. El excesivo flujo entrante de calcio produce la activación desordenada de una amplia gama de

sistemas enzimáticos (proteasas, lipasas y nucleasas) . Estas enzimas y sus productos metabólicos, tal como radicales libres de oxígeno, dañan membranas celulares, material genético y proteínas estructurales en las neuronas, produciendo por último la muerte celular de neuronas (Dirnagl, U. et al. (1999) Trends Neurosci. 22: 391397) .

Los ictus empiezan repentinamente, se desarrollan rápidamente, y producen la muerte de tejido cerebral en minutos a días. En el cerebro isquémico, comúnmente se distinguen dos volúmenes de tejido -el núcleo del infarto y la zona circundante, conocida como penumbra isquémica -el margen subperfundido y metabólicamente comprometido que rodea el núcleo irrevocablemente dañado. El núcleo y la penumbra se caracterizan por dos tipos diferentes de muerte celular: necrosis y apoptosis (que también se llama muerte celular programada o muerte celular neuronal retrasada) . La grave deficiencia de perfusión en el núcleo causa una rotura de procesos metabólicos, suministro de energía celular y homeostasis iónica, que produce que las células pierdan su integridad en minutos. Por tanto, la necrosis aguda de células y tejido predomina en el núcleo. En la penumbra, se mantiene alguna perfusión residual por vasos colaterales, que pueden ser incapaces de mantener el metabolismo funcional completo, pero previene la desintegración estructural inmediata. Sin embargo, a lo largo del tiempo (de horas a varios días) , la alteración de la homeostasis celular produce que mueran más y más células, y el volumen del infarto aumenta. Por tanto, la penumbra se tiene que considerar como tejido en riesgo durante la maduración del infarto. En esta región, las cascadas de señalización de apoptosis e inflamatoria desempeñan un papel importante. Puede constituir inicialmente el 50% del volumen que terminará como infarto. Los mecanismos que llevan a la muerte celular retrasada proporcionan dianas para una terapia neuroprotectora específica en regiones cerebrales expuestas a isquemia, pero que aún son viables.

Las opciones terapéuticas hasta ahora son muy decepcionantes: la trombólisis con rtPA, la única terapia con eficacia probada en un ensayo clínico principal (NINDS) , solo es eficaz en un intervalo de tiempo de tres horas, lo que limita su aplicación a solo un pequeño porcentaje de pacientes con ictus isquémico. En otras palabras, además de la terapia compasiva básica, actualmente más del 95% de los ictus no se pueden tratar específicamente. Esto está en fuerte contraste con nuestro conocimiento respecto a la patofisiología básica de la enfermedad, que ha surgido a lo largo de la última década. En particular, se ha acumulado conocimiento extenso sobre mecanismos de daño cerebral parenquimatoso y neuroprotección endógena, así como reorganización funcional y estructural.

Recientemente, la atención se ha enfocado sobre los potenciales papeles terapéuticos para proteínas cerebrales endógenas que poseen propiedades neuroprotectoras. EPO, una hormona glicoproteína producida principalmente por células... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica una variante de eritropoyetina (EPO) seleccionado del grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican la forma madura de los polipéptidos denominados hs3, h1-4, h1-5, hs4, h11, h2-1, mS, mG3, mG5, m301, mK3, ha, hAma, hAmE y hA-10 que tienen la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 50, 51, 52, y 53, respectivamente;

(b) un polinucleótido que codifica la forma madura del polipéptido denominado secuencia ha sin líder que consiste en la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 61;

(c) polinucleótidos que tienen la secuencia codificante, como se muestra en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57 y 58 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

(d) un polinucleótido que consiste en la secuencia codificante, como se muestra en SEQ ID NO: 60 que codifica la forma madura del polipéptido denominado secuencia ha sin líder;

(e) polinucleótidos que codifican una versión humanizada de los polipéptidos mS, mG3, mG5, m301 y mK3 que consisten en la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, y 22;

(f) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una fusión de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 24, 26, 28 y 30, en el extremo N de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 32, 34, 36 y 38, en donde dicha fusión tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora, pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(g) polinucleótidos que comprenden una fusión de secuencias polinucleotídicas seleccionadas del grupo de secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID NO: 23, 25, 27 y 29, en 5’ de una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo de secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID: 31, 33, 35

y 37, en donde dicha fusión tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(h) polinucleótidos que codifican un derivado de un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de (a) a (g) , en donde en dicho derivado entre 1 y 10 residuos de aminoácidos están conservadoramente sustituidos comparado con dicho polipéptido, y dicho derivado tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(i) polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido n codificado por un polinucleótido de cualquiera de (a) a (h) , en donde en dicho fragmento entre 1 y 10 aminoácidos se delecionan N-y/o Cterminalmente y/o entre 1 y 10 aminoácidos se delecionan N-y/o C-terminalmente de la unión comparado con dicho polipéptido, y dicho fragmento tiene actividad protectora de células y en particular

neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(j) polinucleótidos que son al menos el 95% idénticos a un polinucleótido como se ha definido en cualquiera de (a) a (d) y que al mismo tiempo tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(k) polinucleótidos cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido como se ha definido en cualquiera de (a) a (j) y que codifica un polipéptido que tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(l) polinucleótidos que codifican un polipéptido variante de EPO, que comprende una parte N-terminal de EPO de longitud completa que incluye la hélice A y que carece al menos de uno de los siguientes:

(i) un fragmento de al menos 10 aminoácidos entre la hélice A y la hélice B; 45 (ii) un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la hélice B;

(iii) un fragmento de al menos 6 aminoácidos entre la hélice B y la hélice C;

(iv) un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la hélice C;

(v) un fragmento de al menos 20 aminoácidos entre la hélice C y la hélice D; y/o

(vi) un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la hélice D; en donde dicha variante tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(m) polinucleótidos que codifican un derivado de un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de (l) , en donde en dicho derivado entre 1 y 10 residuos de aminoácidos están conservadoramente sustituidos comparados con dicho polipéptido, y dicho derivado tiene actividad protectora de células y en 55 particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

(n) polinucleótidos cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas con polinucleótidos como se han definido en cualquiera de (l) a (m) y que codifican un polipéptido que tiene actividad protectora de células y en particular neuroprotectora pero esencialmente ninguna actividad hematopoyética;

o la hebra complementaria de tal polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1 que es ADN, ADN genómico o ARN.

3. Un vector que contienen el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

4. El vector de la reivindicación 3 en el que el polinucleótido está operativamente unido a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células huésped procariotas y/o eucariotas.

5. Una célula huésped genéticamente manipulada con el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 o el vector de la reivindicación 3 o 4.

6. Un mamífero transgénico no humano seleccionado del grupo de primate no humano, caballo, bovino, oveja, cabra, cerdo, perro, gato, conejo, ratón, rata, cobaya, hámster y gerbillo que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, un vector de la reivindicación 3 o 4 y/o una célula huésped de la reivindicación 5.

7. Un proceso para producir un polipéptido variante de EPO codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1

o 2 que comprende: cultivar la célula huésped de la reivindicación 5 y recuperar el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

8. El proceso de la reivindicación 7, que comprende además el paso de modificar dicha variante de EPO, en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en oxidación, sulfatación, fosforilación, adición de 15 oligosacáridos o combinaciones de las mismas.

9. Un proceso para producir células capaces de expresar al menos una de las variantes de EPO que comprende manipular genéticamente células in vitro con el vector de la reivindicación 3 o 4, en donde dicho (s) polipéptido (s) variante (s) de EPO está (n) codificado (s) por el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 u obtenible por el proceso de la reivindicación 7 u 8.

11. Composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, un vector de la 25 reivindicación 3 o 4, una célula huésped de la reivindicación 5, y/o un polipéptido de la reivindicación 10 y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables.

12. Uso del polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, un vector de la reivindicación 3 o 4, una célula huésped de la reivindicación 5, o un polipéptido de la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para el 30 tratamiento o la prevención de una afección asociada con daño tisular debido a muerte celular.

13. Uso según la reivindicación 12, en donde dicha muerte celular está inducida por isquemia, hipoxia, infección bacteriana, infección vírica, inducida autoinmunológica, traumática, químicamente o inducida por radiación.

14. Uso según las reivindicaciones 12 o 13, en donde dicha afección es un trastorno neurodegenerativo y/o neuroinflamatorio agudo o crónico, es un trastorno agudo o crónico del corazón, pulmón, riñón, hígado o páncreas o dicha afección está asociada con un trasplante de órgano o células.

15. Uso según la reivindicación 14, en donde dicho trastorno neurodegenerativo y/o neuroinflamatorio agudo se selecciona del grupo que consiste en isquemia o infarto cerebral incluyendo oclusión embólica y oclusión trombótica, reperfusión después de isquemia aguda, lesión hipóxica-isquémica perinatal, paro cardiaco, hemorragia intracraneal, hemorragia subaracnoidea y lesiones intracraneales, lesiones de la médula espinal, lesiones intravertebrales, síndrome del niño zarandeado, encefalitis infecciosa, meningitis, y dolor de cabeza.

16. Uso según la reivindicación 14, en donde dicho trastorno neurodegenerativo y/o neuroinflamatorio crónico se selecciona del grupo que consiste demencias, enfermedad de Pick, enfermedad con cuerpos de Lewy difusos, parálisis supranuclear progresiva (síndrome de Steel-Richardson) , esclerosis múltiple, atrofia de sistemas múltiples, afecciones epilépticas crónicas asociadas con neurodegeneración, enfermedades de neuronas motoras, ataxias degenerativas, degeneración basal cortical, complejo de demencia de ELA-Parkinson de 50 Guam, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, sinucleinopatías, afasia progresiva primaria, degeneración nigroestriatal, enfermedad de MachadoJoseph/ataxia espinocerebelar de tipo 3 y degeneraciones olivopontocereberales, enfermedad de Gilles de La Tourette, parálisis bulbar y pseudobulbar, atrofia muscular raquídea y bulborraquídea (enfermedad de Kennedy) , esclerosis lateral primaria, paraplejia espástica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffman,

enfermedad de Kugelberg-Welander, enfermedad de Tay-Sach, enfermedad de Sandhoff, enfermedad espástica familar, paraparesia espástica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, disautonomia familiar (síndrome de Riley-Day) , polineuropatías, enfermedades por priones, adicción, trastornos afectivos, trastornos esquizofrénicos, síndrome de fatiga crónica, dolor crónico.

17. Uso según las reivindicaciones 13 o 14, en donde dicha afección es envejecimiento.

18. Uso según las reivindicaciones 13 o 14, en donde el medicamento se administra antes de o después del inicio de dicha afección.

Fig. 18

hA (Hélice A de hWT-EPO) -SEQ ID NO 55

hAmA (Mutante de alanina en la hélice A de hWT-EPO) SEQ ID NO 56

hAmE (Mutante de ácido glutámico en la hélice A de hWT-EPO) SEQ ID NO 57

hA-10 (Hélice A de hWT-EPO menos 10aa) -SEQ ID NO 58

hA-20 (Hélice A de hWT-EPO menos 20aa) -SEQ ID NO 59

Fig. 19

A -ADN de hA sin líder: (Hélice A de hWT-EPO sin secuencia de transporte líder) -SEQ ID N.

60. (proteína exportada madura)

Secuencia líder (SEQ ID NO 63) :

B -Aminoácidos de hA sin líder: (Hélice A de hWT-EPO sin secuencia de transporte líder) -SEQ ID N.

61. (proteínas exportadas maduras) : APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENIT Secuencia líder (SEQ ID NO 62) : MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLG