Cepas que producen adipoil-7-ADCA.

Un método para la construcción de una cepa microbiana mutante capaz de producir un compuesto de ß-lactamaadipoilada en N cuando se cultivan en un medio de cultivo que comprende ácido adípico y que tiene un rendimientomejorado de incorporación del ácido adípico desde el medio de cultivo dentro del compuesto de ß-lactamaadipoilada en N en comparación con la cepa parental no mutante,

comprendiendo el método de las operaciones de:

a) Obtener conidiosporas de una cepa microbiana parental capaz de producir un compuesto de ß-lactamaadipoilada en N

b) Someter a la conidiosporas obtenidas en la etapa a) a condiciones mutagenizantes

c) Cultivar las conidiosporas obtenidas en la etapa b) en un medio que contiene ácido adípico como la principalfuente de carbono, con lo que las esporas que son capaces de usar ácido adípico como una fuente de carbonogerminarán, crecerán y formarán un micelio

d) Separar el micelio desde las conidiosporas remanentes

e) Opcionalmente repetir las etapas b) y c) y d) una o más veces,

f) Inocular las conidiosporas procedentes de la etapa d) en un medio que contiene una fuente apropiada decarbono para permitir el crecimiento de colonias individuales.

g) Replicar las colonias que crecen, procedentes de la etapa f), en un medio que contiene una apropiada cantidadde ácido adípico para permitir la identificación de colonias que no crecen o que crecen más lentamente.

h) Seleccionar las colonias que crecen en la etapa f) y las que pertenecen a las colonias que no crecen o quecrecen más lentamente de la etapa g).

Cepas que producen adipoil-7-ADCA

Campo del invento El presente invento se refiere a unas cepas microbianas capaces de producir un compuesto de β-lactama adipoilada en N cuando se cultivan en un medio de cultivo que comprende ácido adípico.

Antecedentes del invento Los antibióticos semisintéticos de β-lactamas (SSA's) se producen a una escala industrial partiendo de diversos compuestos intermedios de β-lactamas tales como el ácido 6-amino-penicilánico (6-APA) , el ácido 7-aminodesacetoxi-cefalosporánico (7-ADCA) , el ácido 7-amino-cefalosporánico (7-ACA) y un 7-amino-3-cloro-3-cefemo-4carboxilato (7-ACCA) , un 7-amino-3-[ (Z/E) -1-propen-1-il]-3-cefemo-4-carboxilato (7-PACA) , el ácido 7-aminodesacetil-cefalosporánico (7-ADAC) , el ácido 7-amino-3-carbamoiloximetil-3-cefemo-4-carboxílico (7-ACCCA) y otros.

El producto 7-ADCA de la primera generación se derivaba de la penicilina G (PenG) realizándose que tanto la expansión del anillo de penemo de 5 miembros para formar el anillo de cefemo de 6 miembros y la subsiguiente disociación de la cadena lateral de ácido fenilacético del fenilacetil-7-ADCA se llevaban a cabo usando reacciones químicas. El producto 7-ADCA de la siguiente generación se obtenía todavía partiendo de la PenG pero, después de la expansión química del anillo, la cadena lateral de ácido fenilacético del fenilacetil-7-ADCA era disociada enzimáticamente usando una apropiada (penicilin) acilasa. Se han desarrollado otros procedimientos en los que también la expansión del anillo de PenG para formar el fenilacetil-7-ADCA se lleva a cabo in vitro usando una apropiada enzima expandasa, pero estos procedimientos tienen poca importancia industrial.

El procedimiento más elegante de producción para el 7-ADCA comprende la cultivación de un Penicillium chr y sogenum transformado con, y que expresa, un gen que codifica una apropiada expandasa. Esta cepa de 25 Penicillium chr y sogenum tratada, cuando crece en la presencia de ácido adípico como el compuesto precursor de cadena lateral en el recipiente de fermentación, produce y excreta adipoil-7-ADCA -véanse el documento de solicitud de patente internacional WO93/05158. y la cita de Crawford y colaboradores (Bio/ (Technol. 1995) 13, 5862) o, para la expresión en Cephalosporium acremonium, la cita de Gutiérrez y colaboradores (Mol. Gen. Genetics (1991) 225, 56-64) . En este procedimiento de producción, el adipoil-7-ADCA es recuperado a partir del caldo de 30 fermentación, sometido a una apropiada acilasa para disociar la cadena lateral de ácido adípico, después de lo cual el 7-ADCA así obtenido es purificado, cristalizado y secado ulteriormente. Otros apropiados compuestos precursores de cadenas laterales han sido descritos en el documento WO95/04148 (el ácido 2- (carboxietiltio) acético y el ácido 3 (carboximetiltio) -propiónico) , en el documento WO95/04149 (el ácido 2- (carboxietiltio) propiónico) , en el documento WO96/38580 (el ácido fenil-acético) y en los documentos WO98/048034 y WO98/048035 (diversos ácidos 35 dicarboxílicos) . La expandasa cataliza la expansión del anillo de 5-miembros de los diversos ácidos penicilánicos acilados en N, proporcionando de esta manera los correspondientes ácidos desacetoxi-cefalosporánicos acilados en N.

Sin embargo, además de ser usado como el compuesto precursor de cadena lateral, un adipato puede ser degradado y usado como una fuente de carbono en el metabolismo primario del organismo capaz de producir el 40 compuesto de N-adipoíl β-lactama. Esto fue demostrado por ejemplo por Robin y colaboradores (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 57, 357-362) ) en cultivos discontinuos con sacarosa como la fuente primaria de carbono. Después del agotamiento de la glucosa y la fructosa (derivadas de la sacarosa) , comenzaba la formación de adipoíl-6-APA y adipoíl-7-ADCA en esta etapa solamente se incorporaba hasta un 2 % del ácido adípico en los compuestos de β-lactama, mientras que el resto se usaba como una fuente de carbono. Se sugirió por los autores que, debido a 45 la similaridad entre el ácido adípico y ciertos ácidos grasos, era probable que la degradación de ácido adípico se produjese por oxidación en posición β. En un estudio posterior Thykaer y colaboradores (Metabolic Engineering (2002) , 4, 151-158) , sobre la base de un análisis de la red metabólica de una cepa de Penicillium chr y sogenum productora de adipoil-7-ADCA, llegaron a la conclusión de que la degradación del adipato tiene lugar en los microcuerpos (glioxisomas) por enzimas de oxidación en posición β y no en el citosol ni en los mitocondrios.

La naturaleza de la ruta de oxidación en posición β en hongos (filamentosos) y levaduras en general y en Penicillium chr y sogenum en particular, todavía es oscura en lo que se refiere a la localización intracelular, las enzimas implicadas, así como el cometido de la ruta de oxidación en posición β en el metabolismo total del microorganismo. Con el fin de reducir la degradación del ácido adípico, ha sido sugerido por Thykaer y colaboradores (2002) suprimir la enzima responsable de la degradación del adipato, pero sin especificar que ninguna de dichas enzimas sea un 55 candidato apropiado.

Puesto que un adipato es costoso en comparación con la glucosa o el glicerol, es indeseable la degradación del adipato durante la producción del compuesto N-adipoíl β-lactama. En vez de ello, desde un punto de vista de procesos de producción a escala industrial, es muy deseable un rendimiento de incorporación cercano al 100 %.

Descripción detallada del invento La divulgación proporciona una cepa microbiana mutante derivada de una cepa microbiana parental capaz de producir un compuesto de β-lactama adipoilada en N, cuando se cultiva en un medio que comprende ácido adípico, caracterizada porque la cepa microbiana mutante tiene un rendimiento mejorado de incorporación del ácido adípico desde el medio de cultivo dentro del compuesto de β-lactama adipoilada en N. El rendimiento de incorporación es definido aquí como el porcentaje molar de ácido adípico incorporado en el compuesto de β-lactama adipoilada en N en relación con la cantidad molar total de ácido adípico consumido. La cantidad molar total de ácido adípico consumido es igual a la cantidad molar total de ácido adípico añadido al proceso de fermentación menos la cantidad molar de ácido adípico que queda después del proceso de fermentación. Esto puede ser ilustrado por el siguiente ejemplo: cuando en un proceso de fermentación discontinuo, mientras que se cultiva un microorganismo capaz de producir un compuesto de β-lactama adipoilada en N, la concentración inicial de adipato en el medio es de 50 mM y al final de la fermentación se forman 10 mM del compuesto de β-lactama adipoilada en N y quedan en el medio de fermentación 15 mM de adipato, entonces el rendimiento de incorporación asciende a: 10/ (50-15) *100 = 29 %. Similarmente, cuando se forman 40 mM del compuesto de β-lactama adipoilada en N y no queda adipato en el medio de fermentación, el rendimiento de incorporación asciende a 40/50*100 = 80 %.

El rendimiento mejorado de incorporación puede ser expresado como la mejoría relativa si la cepa microbiana mutante comparada con la cepa microbiana parental. Por ejemplo, cuando la cepa microbiana parental tiene un rendimiento de incorporación de 5 %, como más arriba se ha definido, y la cepa microbiana mutante tiene uno de 6 %, entonces el rendimiento mejorado de incorporación de la mutante es de 20 % (6/5*100 - 100) .

De manera preferible, la cepa mutante de la divulgación tiene un rendimiento mejorado de incorporación de por lo menos 5 %, más preferiblemente de por lo menos 7, 5 %, más preferiblemente de por lo menos 10 %, más preferiblemente de por lo menos 15 %, más preferiblemente de por lo menos 20 %, más preferiblemente de por lo menos 30 %, más preferiblemente de por lo menos 40 %, más preferiblemente de por lo menos 50 %, más preferiblemente de por lo menos 60 %, más preferiblemente de por lo menos 70 %, más preferiblemente de por lo menos 80 %, más preferiblemente de por lo menos 90 %, más preferiblemente de por lo menos 95 %, más preferiblemente de por lo menos 97 %, más preferiblemente de por lo menos 98 %, más preferiblemente de por lo menos 99 %, y lo más preferiblemente de por lo menos 100 %.

El rendimiento mejorado de incorporación máxima que se puede obtener es dependiente del rendimiento real de incorporación de la cepa microbiana parental. Cuando la cepa microbiana parental tiene un rendimiento de incorporación de 5 % y un 100 % es el rendimiento teórico de incorporación máxima, entonces la cepa microbiana mutante puede tener un rendimiento... [Seguir leyendo]

1. Un método para la construcción de una cepa microbiana mutante capaz de producir un compuesto de β-lactama adipoilada en N cuando se cultivan en un medio de cultivo que comprende ácido adípico y que tiene un rendimiento mejorado de incorporación del ácido adípico desde el medio de cultivo dentro del compuesto de β-lactama adipoilada en N en comparación con la cepa parental no mutante, comprendiendo el método de las operaciones de:

a) Obtener conidiosporas de una cepa microbiana parental capaz de producir un compuesto de β-lactama adipoilada en N

b) Someter a la conidiosporas obtenidas en la etapa a) a condiciones mutagenizantes c) Cultivar las conidiosporas obtenidas en la etapa b) en un medio que contiene ácido adípico como la principal 10 fuente de carbono, con lo que las esporas que son capaces de usar ácido adípico como una fuente de carbono germinarán, crecerán y formarán un micelio d) Separar el micelio desde las conidiosporas remanentes e) Opcionalmente repetir las etapas b) y c) y d) una o más veces,

f) Inocular las conidiosporas procedentes de la etapa d) en un medio que contiene una fuente apropiada de carbono para permitir el crecimiento de colonias individuales. g) Replicar las colonias que crecen, procedentes de la etapa f) , en un medio que contiene una apropiada cantidad de ácido adípico para permitir la identificación de colonias que no crecen o que crecen más lentamente. h) Seleccionar las colonias que crecen en la etapa f) y las que pertenecen a las colonias que no crecen o que crecen más lentamente de la etapa g) .

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el rendimiento mejorado de incorporación es de por lo menos 5 %, en donde dicho rendimiento mejorado de incorporación es expresado como la mejoría relativa de la cepa microbiana mutante en comparación con la cepa microbiana parental.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto de β-lactama adipoilada en N se selecciona entre el

conjunto que consiste en el adipoíl-6-APA, el adipoíl-7-ADCA, el adipoíl-7-ACA, el adipoíl-7-ACCA, el adipoíl-725 PACA, el adipoíl-7-ADAC y el adipoíl-7-ACCCA.

4. El método de las reivindicaciones 1-3, en el que la cepa es un hongo o una bacteria.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el hongo pertenece al género Penicillium.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el hongo es Penicillium chr y sogenum, transformado preferiblemente con, y que expresa, un gen que codifica una expandasa o una expandasa/hidrolasa.