Producción de antibióticos de ß-lactama.

Un procedimiento para la preparación de un antibiótico de N-α

-amino-hidroxifenilacetil-β-lactama o un antibiótico de N-α-amino-fenilacetil-β-lactama, que comprende poner en contacto un tripéptido hidroxifenilglicil-cisteinil-valina (HpgCV) o un tripéptido fenilglicil-cisteinil-valina (PgCV) con una IPNS para efectuar la formación del antibiótico de N-α-amino-hidroxifenilacetil-β-lactama o el antibiótico de N-α-amino-fenilacetil-β-lactama, y en el que la IPNS tiene un grado de identidad de al menos 50% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y, cuando está alineada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, contiene una arginina, lisina o histidina en la posición 185 y, opcionalmente, una modificación en al menos una de las posiciones 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, utilizando la numeración de posiciones de SEQ ID NO: 1

Producción de antibióticos de β-lactama

Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de antibióticos de β-lactama.

Antecedentes de la invención Los antibióticos de β-lactama son la familia mayor de metabolitos secundarios producidos en la naturaleza por parte de microorganismos. Las clases más importantes de los antibióticos de β-lactama, tanto clínica como económicamente, son las penicilinas (penam) y cefalosporinas (cefem) . Su biosíntesis se produce a través de una vía compleja de etapas enzimáticas. Las primeras dos etapas son las etapas claves en las vías biosintéticas de las clases penam y cefem de antibióticos de β-lactama. Después de estas dos etapas, las vías biosintéticas hacia las penicilinas y cefalosporinas divergen. La primera etapa en la biosíntesis de los antibióticos penicilina, cefalosporina y cefamicina es la condensación de los isómeros L de tres aminoácidos, ácido L-α-amino-adípico (A) , L-cisteína (C) y L-valina (V) en un tripéptido, δ- (L-α-aminoadipil) -L-cisteinil-D-valina o ACV. Esta etapa es catalizada por la δ- (L-αaminoadipil) -L-cisteinil-D-valina sintetasa o ACVS. En la segunda etapa, el tripéptido ACV se cicla oxidativamente por la acción de isopenicilina N-sintasa (a la que se alude aquí en lo que sigue como IPNS) o ciclasa. El producto de esta reacción es isopenicilina N; este compuesto contiene las estructuras de anillo de β-lactama y tiazolidina típicas y posee actividad antibacteriana. A partir de isopenicilina N se forman las penicilinas G o V mediante intercambio de la cadena lateral de α-aminoadipilo hidrofílica por una cadena lateral hidrofóbica. Las cadenas laterales comúnmente utilizadas en procesos industriales son ácido fenilacético (PA) , que proporciona penicilina G,

o ácido fenoxiacético (POA) , que proporciona penicilina V; esta reacción de intercambio es catalizada por la enzima aciltransferasa (AT) .

Debido a la especificidad para el sustrato de la enzima AT no es posible intercambiar la cadena lateral de αaminoadipilo por cualquier cadena lateral de interés, a pesar de que se demostró que podrían intercambiarse el ácido adípico y determinados tio-derivados del ácido adípico (véanse los documentos WO 95/04148 y WO 95/04149) . En particular, las cadenas laterales penicilinas y cefalosporinas industrialmente importantes no pueden ser intercambiadas directamente a través de AT. Por consiguiente, la mayoría de los antibióticos de β-lactama actualmente utilizados se preparan por métodos semi-sintéticos. Estos antibióticos de β-lactama semi-sintéticos se obtienen modificando un producto de β-lactama N-sustituido mediante una o más reacciones químicas y/o enzimáticas. Estos métodos semi-sintéticos tienen la desventaja de que incluyen muchas etapas, son contaminantes del medio ambiente y son más bien costosos. Por lo tanto, sería muy deseable disponer de una vía completamente fermentativa hacia antibióticos de β-lactama, por ejemplo hacia amoxicilina, ampicilina, cefadroxil y cefalexina.

Se pueden pensar diversas opciones para una vía completamente fermentativa hacia antibióticos penam y cefem semi-sintéticos.

Por ejemplo, se podría centrar la atención al intercambio de la cadena lateral de α-aminoadipilo de isopenicilina N por la cadena lateral apropiada de interés, p. ej. la cadena lateral de α-amino-p-hidroxifenilacetilo en el caso de amoxicilina. Esto requeriría la modificación de la especificidad por el sustrato de la enzima AT, dado que la enzima nativa tiene una especificidad para el sustrato más bien estrecha y no es capaz de catalizar un intercambio de este tipo. Además, esto requeriría la modificación de la enzima CoA ligasa que activa la cadena lateral a ser intercambiada.

Alternativamente, se podría se podría centrar la atención a la modificación de las primeras dos etapas en la vía biosintética de pencilina, de modo que la amoxicilina sea directamente sintetizada y secretada. Sin embargo, esto requeriría una modificación sustancial de las enzimas ACVS e IPNS.

Por ejemplo, para amoxicilina, primeramente se requeriría la producción de un tripéptido que produjera la cadena lateral de amoxicilina, es decir, el tripéptido D-p-hidroxifenilglicil-L-cisteinil-D-valina, en lugar de ACV. En segundo lugar, se requeriría que una enzima fuese capaz de ciclar este tripéptido.

ACVS es una péptido sintetasa no ribosomal (NRPS) que cataliza la formación del tripéptido LLD-ACV (δ- (L-αaminoadipil) -L-cisteinil-D-valina) . En este tripéptido se forma un enlace péptido entre el grupo δ-carboxílico del ácido L-α-aminoadípico y el grupo amino de L-cisteína y, adicionalmente, la conformación estereoquímica de valina cambia de L a D.

En los últimos años, varios laboratorios e instituciones examinaron las opciones de la ingeniería dirigida de NRPS. Como estrategias principales, los dominios y módulos fueron intercambiados y, como consecuencia, se introdujeron nuevas especificidades que conducían a productos peptídicos cambiados. En la mayoría de los casos, las estrategias de ingeniería fueron restringidas a los fragmentos de enzima del mismo organismo (o incluso de la misma NRPS) , limitando seriamente las opciones de una ingeniería de la enzima. Un problema principal de la ingeniería actual de la NRPS acometido en la bibliografía es el cambio de estereoquímica de un aminoácido del péptido, es decir, un cambio de la estereoquímica L a D. Un dominio de condensación formador de enlace peptídico, situado inmediatamente más abajo de un dominio de epimerización, es D-específico para el donante peptidilo o aminoacilo, y es L-específico para el aceptor aminoacilo. Un dominio de condensación de este tipo se representa como DCL. Un dominio LCL en esta posición no proporciona la condensación de los restos del donante y aceptor (Clugston S.L. et al. 2003, Biochemistr y , 42, 12095-12104) . Un problema adicional que puede limitar las opciones de la ingeniería es que los dominios C y A se consideran como un par inseparable (Mootz H. D. et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5848-5853) .

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que es factible la ingeniería de ACVS para proporcionar una enzima tratada por ingeniería y es capaz de catalizar la formación de un tripéptido HpgCV o PgCV, en donde en el enlace peptídico N-terminal se utiliza un grupo α-carboxílico en lugar del grupo δ-carboxílico que se utiliza en el tripéptido ACV natural y, adicionalmente, que es capaz de modificar la configuración estereoquímica L del primer aminoácido a una configuración D.

Varios grupos han investigado adicionalmente la especificidad para el sustrato de la enzima IPNS. Para revisiones sobre este tema, véase Baldwin y Bradley, Chem. Rev. 1990, 90, 1079-1088 y Huffman et al. J. Med. Chem. 1992, 35, 1897-1914.

J. M. Luengo et al. (Bio/Technol. 1986, 4, 44) y T.R.M. Barends et al. (Curr. Opinion Biotechnol. 2004, 15, 356) describen el papel de IPNS en la formación de antibióticos de β-lactama a partir de tripéptidos. A pesar de que el primer documento menciona la ciclación directa de fenilacetil-cisteinil-valina para formar penicilina G mediante IPNS, no se mencionan otras conversiones y, a este respecto, es interesante señalar que Huffman et al. (J. Med. Chem. 1992, 35, 1897) informaron de la ausencia de actividad antibiótica cuando se utiliza m-COOH-DL-fenilglicil-L-cistenil-D-valina o p-hidroxifenilacetil-L-cisteninil-D-valina como sustrato para IPNS. La posibilidad de modificar enzimas IPNS se menciona en el documento WO 98/16648, pero sin ninguna guía técnica.

Sorprendentemente, se encuentra también que la enzima IPNS nativa es capaz de actuar sobre los tripéptidos hidroxifenilglicil-cisteinil-valina (HpgCV) y fenilglicil-cisteinil-valina (PgCV) , más particularmente sobre las variantes de DLD de estos tripéptidos. El hallazgo de esta característica de IPNS abre el camino a desarrollos ulteriores, entre los que se encuentra el rastreo de variantes de IPNS para aislar moléculas de IPNS con una actividad mejorada sobre estos péptidos no nativos. Los hallazgos de la presente invención permiten por vez primera una producción completamente fermentativa de antibióticos que anteriormente solamente podían ser obtenidos a través de vías semi-sintéticas.

Descripción detallada de la invención Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de un antibiótico de N-α-amino-hidroxifenilacetil-β-lactama o un antibiótico de N-α-amino-fenilacetil-β-lactama, que comprende poner en contacto un tripéptido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de un antibiótico de N-α-amino-hidroxifenilacetil-1-lactama o un antibiótico de N-α-amino-fenilacetil-1-lactama, que comprende poner en contacto un tripéptido hidroxifenilglicil-cisteinil-valina (HpgCV) o un tripéptido fenilglicil-cisteinil-valina (PgCV) con una IPNS para efectuar la formación del antibiótico de N-α-amino-hidroxifenilacetil-1-lactama o el antibiótico de N-α-amino-fenilacetil-1-lactama, y en el que la IPNS tiene un grado de identidad de al menos 50% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y, cuando está alineada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, contiene una arginina, lisina o histidina en la posición 185 y, opcionalmente, una modificación en al menos una de las posiciones 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, utilizando la numeración de posiciones de SEQ ID NO: 1.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tripéptido HpgCV o el tripéptido PgCV se prepara poniendo en contacto los aminoácidos hidroxifenilglicina (Hpg) o fenilglicina (Pg) , cisteína (C) y valina (V) con una péptido sintetasa no ribosomal (NRPS) para efectuar la formación del tripéptido HpgCV o del tripéptido PgCV, comprendiendo la NRPS un primer módulo M1 específico para Hpg o Pg, un segundo módulo M2 específico para C y un tercer módulo M3 específico para V.

3. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la hidroxifenilglicilcisteinil-valina es DLD-p-hidroxifenilglicil-cisteinil-valina y el antibiótico de N-α-amino-hidroxifenilacetil-1-lactama es amoxicilina.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la fenilglicil-cisteinilvalina es DLD-fenilglicil-cisteinil-valina y el antibiótico de N-α-aminofenilacetil-1-lactama es ampicilina.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que IPNS efectúa la formación de un antibiótico de 1-lactama penam, y el antibiótico de 1-lactama penam se convierte adicionalmente en un antibiótico de 1-lactama cefem.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el antibiótico de 1-lactama cefem es cefadroxil o cefalexina.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se realiza in vivo.

8. Una enzima IPNS variante que tiene un grado de identidad de al menos 50% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que, cuando está alineada con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, contiene una arginina, lisina o histidina en la posición 185 y, opcionalmente, una modificación en al menos una de las posiciones 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, utilizando la numeración de posiciones de SEQ ID NO: 1.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el primer módulo M1 específico para Hpg se puede obtener a partir de una CDA sintetasa, una cloroerenomicina sintetasa y/o una complestatina sintetasa.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el primer módulo M1 específico para Pg se puede obtener a partir de una pristinamicina sintetasa.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el módulo M2 comprende un dominio DCL que está fusionado a un dominio A que se puede obtener a partir del segundo módulo de una ACVS, en donde el dominio DCL es heterólogo con respecto al dominio A.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el dominio DCL del módulo M2 se puede obtener a partir de la enzima que es la fuente del primer módulo M1.

13. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 11-12, en el que el dominio DCL del módulo M2 es el dominio C del séptimo módulo de una CDA sintetasa.

14. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 11-13, en el que el dominio DCL del módulo M2 es el dominio C del segundo módulo de una iturina sintetasa.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los dominios A y T del módulo M2 y el módulo M3 completo se pueden obtener de una ACVS, preferiblemente una ACVS bacteriana o fúngica.

16. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ADN que codifica la IPNS de la reivindicación 8.

17. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 16.

.

18. El hospedador de la reivindicación 17, transformado adicionalmente con genes de la vía biosintética a los aminoácidos Hpg o Pg.

19. El hospedador de la reivindicación 17 ó 18, que comprende la vía biosintética a los antibióticos de 1-lactama, 10 preferiblemente en donde los genes que codifican ACVS y/o IPNS están inactivados.

20. Un procedimiento para la producción de un antibiótico de N-α-amino-hidroxifenilacetil-1-lactama o un antibiótico de N-α-amino-fenilacetil-1-lactama, que comprende cultivar el hospedador de una cualquiera de las reivindicaciones 17-19 bajo condiciones que conducen a la producción del antibiótico de 1-lactama.

1.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el antibiótico de 1-lactama es amoxicilina, ampicilna, cefadroxil o cefalexina.