CEPAS DE MICROORGANISMOS OPTIMIZADAS PARA VÍAS DE BIOSÍNTESIS CONSUMIDORAS DE NADPH.

Cepas de microorganismos optimizadas para vías de biosíntesis consumidoras de NADPH. El NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) participa en su forma reducida, NADPH, en las reacciones intracelulares de oxidorreducciones que implican unas enzimas con actividad deshidrogenasa o reductasa. La presente invención se refiere a unas cepas de microorganismos optimizadas para la producción, mediante biotransformación, de moléculas que tienen unas vías de biosíntesis consumidoras de NADPH. Las cepas según la invención se pueden utilizar en unos procedimientos de biotransformación consumidores de NADPH. Las cepas definidas según la invención pueden ser procarióticas o eucarióticas. En un modo de realización preferido, dicha cepa procariótica es una cepa de Escherichia coli. En otro modo de realización, dicha cepa eucariótica es una cepa de Saccharomyces, en particular S. cerevisiae. La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de moléculas por biotransformación que comprende el cultivo en un medio apropiado de una cepa optimizada según la invención, comprendiendo asimismo dicha cepa optimizada los elementos genéticos necesarios para la preparación de dicha molécula. Los procedimientos de biotransformación han sido desarrollados para permitir la producción de moléculas en grandes cantidades a bajo coste, permitiendo al mismo tiempo asimismo la valorización de diferentes sub-productos industriales o de la agricultura. Para producir unas moléculas de interés mediante biotransformación in vivo se distinguirán dos grandes enfoques: - por un lado la fermentación que permite la producción de moléculas por un microorganismo a partir de una fuente de carbono simple (por ejemplo el documento WO0102547) que describe la producción de lisina por fermentación de C. glutamicum en presencia de glucosa), - por otra parte, la bioconversión por un microorganismo de un co-sustrato dado en una molécula de interés (véanse por ejemplo el documento WO0012745 que describe la producción de derivados R-piperidina, y el documento WO 0068397 que describe la producción de tagatosa). El co-sustrato es no asimilable; es diferente de la fuente de carbono que se utiliza sólo para producir la biomasa y el NADPH necesario a la bioconversión. La mejora de un procedimiento de biotransformación puede basarse en diferentes factores tales como la temperatura, la oxigenación, la composición del medio, el procedimiento de recuperación, etc. Se puede prever asimismo la modificación del microorganismo de tal manera que la producción de la molécula de interés y/o su excreción sean aumentadas. En el ámbito de una fermentación, se esforzará por ejemplo en optimizar la vía de biosíntesis, por ejemplo modificando la regulación de los genes o modificando los genes con el fin de modificar las características de las enzimas implicadas, o también optimizando la regeneración de los cofactores. En el marco de la bioconversión, se esforzará más en reducir la formación de co-productos y optimizar la regeneración de cofactores implicados en la(s) etapa(s) de bioconversión. Entre los cofactores implicados en las biotransformaciones, el NADPH toma una parte importante, en particular para la producción de aminoácidos (por ejemplo, arginina, prolina, isoleucina, metionina, lisina), de vitaminas (por ejemplo pantotenato, filoquinona, tocoferol), de moléculas aromáticas (por ejemplo documento WO9401564), de polioles (por ejemplo xilitol), de poliaminas (por ejemplo espermidina), de hidroxiésteres (por ejemplo etil-4-cloro-3-hidroxibutirato) o de otras moléculas de alto valor añadido. La presente invención se refiere por lo tanto a una cepa de microorganismos optimizados para la producción de moléculas que tienen unas vías de biosíntesis consumidoras de NADPH tal como la definida en la reivindicación 1. En lugar de intentar optimizar para cada biotransformación el ratio NADPH/NADP + en el microorganismo, los inventores han optado por la producción de microorganismos modificados con el fin de obtener diferentes ratios NADPH/NADP + , siendo dichos microorganismos modificados utilizados después para realizar las biotransformaciones consumidoras de NADPH. Por "cepa de microorganismos" se entiende, según la invención, un conjunto de microorganismos de una misma especie, que comprende por lo menos un microorganismo de dicha especie. Así, las características descritas para la cepa se aplican a cada uno de los microorganismos de dicha cepa. Asimismo, las características descritas para uno de los microorganismos de la cepa se aplicarán al conjunto de dichos microorganismos que la compone. Entre los microorganismos optimizados según la invención, se citarán las bacterias y las levaduras, los hongos filamentosos y en particular las bacterias y las levaduras de las especies siguientes: Aspergillus sp., Bacillus sp., 2 E04805397 14-11-2011   Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Pénicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp. El principio de la optimización del ratio NADPH/NADP + se describe para E. coli y S. cerevisae. El mismo principio puede ser aplicado de manera similar a todos los microorganismos cultivados en condiciones aerobias. El principio de la optimización del ratio NADPH/NADP + consiste en limitar las actividades enzimáticas implicadas en la oxidación del NADPH, y en favorecer las actividades enzimáticas que permiten la reducción del NADP + . Se limitan las actividades enzimáticas implicadas en la oxidación del NADPH disminuyendo, y más particularmente inactivando, dichas actividades, en particular las actividades de tipo quinona oxidorreductasa y/o transhidrogenasa soluble. Se favorecen las actividades enzimáticas que permiten la reducción del NADP + imponiendo el flujo de carbono a través del ciclo de pentosas fosfato y/o modificando la especificidad de cofactor de por lo menos una enzima de tal manera que ésta utiliza el NADP preferentemente al NAD, su cofactor habitual. Las cepas optimizadas según la invención se obtienen mediante biología molecular. El experto en la materia conoce los protocolos que permiten modificar el carácter genético de los microorganismos. Las técnicas de transformación están documentadas y están al alcance del experto en la materia (Sambrook et al., 1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nueva York). Los procedimientos que permiten limitar una actividad enzimática consisten en modificar el gen que permite su expresión por un medio apropiado, por ejemplo aportando una o varias mutación(es) en la parte que codifica el gen en cuestión, o modificando la región promotora, en particular sustituyéndola por una secuencia que permite disminuir la expresión del gen. Los procedimientos que permiten inactivar una actividad enzimática consisten en inactivar el producto de expresión del gen en cuestión por un medio apropiado, o bien en inhibir la expresión del gen en cuestión, o también suprimir por lo menos una parte del gen en cuestión, de manera que su expresión no tenga lugar (por ejemplo deleción de una parte o del conjunto de la región promotora necesaria para su expresión), o el producto de expresión haya perdido su función (por ejemplo deleción en la parte que codifica el gen en cuestión). De manera preferida, la deleción de un gen comprende la supresión de lo esencial de dicho gen y, llegado el caso, su sustitución por un gen marcador de selección que permite facilitar la identificación, el aislamiento y la purificación de las cepas optimizadas según la invención. La inactivación de un gen en E. coli se lleva a cabo preferentemente mediante recombinación homóloga (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645). Se recuerda brevemente el principio de un protocolo: se introduce en la célula un fragmento lineal, obtenido in vitro, que comprende las dos regiones que flanquean el gen, y por lo menos un gen de selección entre estas dos regiones (generalmente un gen de resistencia a un antibiótico), presentando por lo tanto dicho fragmento lineal un gen inactivado. Se seleccionan las células que han sufrido un evento de recombinación y que tienen el fragmento introducido por exposición sobre medio selectivo. Se seleccionan entonces las células que hayan sufrido un evento de doble recombinación, en las cuales el gen nativo se ha sustituido por el gen inactivado. Este protocolo puede ser mejorado utilizando unos sistemas de selección positiva y negativa, con el fin de acelerar la detección de los eventos de dobles recombinaciones. La inactivación de un gen en S. cervisiae... [Seguir leyendo]

1. Cepa de microorganismo, caracterizada porque comprende la limitación de una o varias actividad(es) que oxidan el NADPH mediante la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una quinona oxidorreductasa y/o una transhidrogenasa soluble, y porque comprende asimismo unas modificaciones que permiten favorecer una o varias actividad(es) enzimática(s) que reducen el NADP + mediante la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una fosfoglucosa isomerasa y/o una fosfofructoquinasa. 2. Cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende asimismo la modificación de uno o varios gen(es) que codifican para una dihidrolipoamida deshidrogenasa y/o una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, con el fin de que utilice(n) preferentemente el NADP. 3. Cepa según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende asimismo la sobreexpresión de uno o varios gen(es) que codifican para una glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, una 6-fosfogluconolactonasa, una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, una isocitrato deshidrogenasa o una transhidrogenasa membranaria. 4. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende asimismo la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una 6-fosfogluconato deshidratasa, una malato sintasa, una isocitrato liasa o una isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa. 5. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende uno o varios genes, endógenos o exógenos, que codifican unas enzimas implicadas en la biotransformación de una molécula de interés. 6. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende uno o varios genes marcadores de selección. 7. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se selecciona de entre las especies siguientes: Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacteritm sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherlchia sp., Gluconobacter sp., Pénicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp. y Candida sp. 8. Procedimiento de preparación de las cepas optimizadas según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se suprime uno o varios gen(es) que codifican para una quinona oxidorreductasa y/o una transhidrogenasa soluble, y se suprime uno o varios gen(es) que codifican para una fosfoglucosa isomerasa, una fosfofructoquinasa, una 6-fosfogluconato deshidratasa, una malato sintasa, una isocitrato liasa o una isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfotasa, y/o porque se modifica uno o varios gen(es) que codifican para una dihidrolipoamida deshidrogenasa y/o una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, con el fin de que utilice(n) preferentemente el NADP, siendo estas deleciones y modificaciones llevadas a cabo mediante un medio apropiado, y/o se sobreexpresa uno o varios gen(es) que codifican para una glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, una 6-fosfogluconolactonasa, una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, una isocitrato deshidrogenasa o una transhidrogenasa membranaria, o bien transformando la cepa con un vector apropiado que comprende uno o varios gen(es) que codifican una o varias enzima(s) implicadas en la biotransformación de una molécula de interés y/o uno o varios gen(es) marcadores de selección, o bien modificando la fuerza del o de los promotor(es) endógeno(s) que controlan el o los gen(es) a sobreexpresar. 9. Procedimiento de producción de una molécula de interés de la cual por lo menos una de las reacciones de la vía de biosíntesis es NADPH-dependiente, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) cultivar unos microorganismos optimizados según una de las reivindicaciones 1 a 7, en un medio de cultivo apropiado que favorece su crecimiento y que comprende las sustancias necesarias para la realización de la biotransformación mediante fermentación o biotransformación, con la excepción del NADPH, y b) extraer la molécula de interés del medio y, llegado el caso, purificarla. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula de interés se selecciona de entre los aminoácidos, las vitaminas, los esteroles, los flavonoides, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los polioles y los hidroxiéteres. E04805397 14-11-2011