La presente invención se refiere a una nueva cepa de Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis que ha sufrido una deleción de 16,

3 Kb por la que carece de genes mce (mammalian cell entry). Así mismo se refiere a un método desarrollado basado en la reacción en cadena de la polimerasa para detectar otras cepas de Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis que carezcan de dichos genes. Además, en la presente invención se refleja la validación de metodologías para el empleo de esta cepa de Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis CECT 7530 en ensayos de invasión in vitro en diferentes líneas celulares de orígenes diversos. Adicionalmente, la presente invención hace mención al desarrollo de métodos para la medición de la viabilidad de Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis en el interior de células eucariotas durante los procesos de invasiones in vitro mediante la estimación del número de copias del gen precursor del ARNr 16S el pre-ARNr 16S.

Cepa de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis tipo II y aplicaciones.

Objeto de la invención La presente invención se refiere a la primera y única cepa de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis mutante para genes de entrada a células mamíferas (mammalian cell entr y genes, mce) . Se trata de un microorganismo que presenta una deleción de 16, 3 Kpb en su genoma que comprende genes mce, miembros de la familia PE/PPE (denominados así debido a las presencia de motivos prolina-ácido glutámico y prolina-prolina-ácido glutámico, respectivamente) y un regulador transcripcional. La cepa objeto de la presente invención fue obtenida de un rebaño de cabras que presentaba una forma paucibacilar de la enfermedad de Johne o paratuberculosis (con una carga bacteriana baja en el interior de los macrófagos) . Por lo tanto, la presente solicitud trata de la primera y única cepa de M. a. paratuberculosis mutante natural de genes mce que puede emplearse como cepa de referencia en ensayos de patogenicidad y virulencia. A su vez, la cepa objeto de la presente invención puede aplicarse en el diseño de nuevos microarrays para estudios de hibridación genómica comparada (HGC) y como sujeto de trabajo en el desarrollo de nuevas vacunas vivas atenuadas.

Estado de la técnica En la actualidad se está realizando el estudio de los factores de virulencia de las bacterias pertenecientes al género Mycobacterium, para así poder entender los mecanismos de interacción patógeno-hospedador durante el transcurso de la infección (Casali, N. et al., 2007, BMC Genomics, 8, 60; Haile, Y. et al., 2002, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 33 (2) , 125-132; Gioffre, A. et al., 2005, Microbes. Infect. 7 (3) , 325-334; Flesselles, B. et al., 1999, FEMS Microbiol. Lett. 177 (2) , 237-242; El-Shazly, S. et al, 2007, Int. J. Tubero. Lung Dis. 11 (6) , 676-682; Parker, S. L. et al., 1995, Clin. Diagn. Lab Inmunol. 2 (6) , 770-775) . De todos los factores implicados en este proceso, de especial interés son aquellos grupos de genes denominados mammalian cell entr y genes (mce) , cuyos productos de expresión génica (las proteínas Mce) son esenciales para la entrada celular y supervivencia en el interior de los macrófagos.

La importancia de estos genes mce se demostró mediante la invasión de células hospedadoras de la línea celular HeLa con una cepa no patogénica de Escherichia coli en cuyo genoma se había insertado el gen mce1A de Mycobacterium tuberculosis (Arruda, S. et al., 1993, Science, 261 (5127) , 1454-1457) . En la actualidad, todos los esfuerzos se están dirigiendo a la creación de nuevos mutantes mce de M. tuberculosis y Mycobacterium bovis. Estos mutantes han demostrado, a través de diferentes experimentos de invasión in vitro, una atenuación en su virulencia e invasividad (Flesselles, B. et al, 1999, FEMS Microbiol. Lett. 177 (2) , 237-242) . Además, también se han observado diferencias en cuanto a los rasgos anatomo-patológicos entre cepas mce mutantes y las cepas salvajes de M. tuberculosis, el primero de los cuales originaba la formación de una formación granulomatosa aberrante en ratones, además de una mayor proliferación de la población linfocítica en comparación con la cepa salvaje (Shimono, N. et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 100 (26) , 15918-15923) .

Dentro de las bacterias del complejo Mycobacterium avium complex (MAC) , entre las que se incluye Mycobacterium avium subespecie avium (M. a. avium) , se observó una correlación directa entre la susceptibilidad a determinados antibióticos, la morfología de las colonias y la expresión de diferentes genes mce. En el mismo estudio demostaron que los fenotipos más virulentos de M. a. avium presentaban una sobre-expresión de los genes mce (Cangelosi, G. A. et al., 2006, Antimicrob. Agents Chemother. 50 (2) , 461-468) .

Dentro de los miembros de MAC se encuentra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (M. a. paratuberculosis) , agente etiológico de la enfermedad de Johne o paratuberculosis. Esta enfermedad se caracteriza por estar ampliamente distribuida tanto a nivel geográfico como de hospedador, aunque se encuentra afectando principalmente a animales de abasto. Además, diversos estudios han descrito que M. a. paratuberculosis es un posible agente contribuyente en la enfermedad de Crohn en el hombre (Harris, N. B. et al, 2001, Veterinar y Medicine. Clin. Microbiol. Rev., 14 (3) , 489-512) . Por todo esto, la correcta caracterización molecular de M. a. paratuberculosis es de crucial importancia para poder implementar las medidas adecuadas para su erradicación.

En este microorganismo, estos genes mce se encuentran repartidos a lo largo de su genoma, formando operones o grupos de seis genes mce y dos genes yrbE, cuyas funciones son la producción de proteínas de unión a sustratos y permeasas para el transporte a través de la membrana celular respectivamente (Casali, N. et al., 2007, BMC Genomics, 8, 60) .

Por otra parte, M. a. paratuberculosis se ha dividido en tres grupos ampliamente diferenciados denominados I (previamente citado como grupo sheep u ovino) , II (denominado con anterioridad grupo cattle ó bovino) y III (intermedio) , los cuales se han subdividido mediante el empleo de diversas técnicas moleculares (de Juan, L. et al., 2006, Vet. Microbiol. 115 (1-3) , 102-110; Dohmann, K. et al, 2003, J. Clin. Microbiol. 41 (11) , 5215-5223; Stevenson, K. et al, 2002, J. Clin. Microbiol., 43 (8) , 3704-3712; Castellanos, E. et al, 2007, J. Clin. Microbiol. 45 (10) , 3439-3442; Castellanos, E. et al., 2008, Proceedings del 9º Coloquio Internacional de Paratuberculosis, 6-8; Griffiths, T. et al., 2008, J. Clin. Microbiol. 46 (4) , 1207-1212) así como requerimientos nutricionales a la hora de su cultivo (de Juan, L. et al, 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72 (9) , 5927-5932) .

En la actualidad existen tan sólo dos cepas de M. a. paratuberculosis de tipo II disponibles para los laboratorios que realizan diferentes estudios de invasión y patogenicidad in vivo e in vitro, entre las cuales se encuentra la única cepa de referencia secuenciada M. a. paratuberculosis K-10, y la cepa vacunal M. a. paratuberculosis 316F. Sin embargo, cepas de M. a. paratuberculosis que sean mce mutantes naturales (genes con una implicación en los mecanismos de entrada del microorganismo en la célula hospedadora) , no están a disposición de ningún laboratorio puesto que nadie ha obtenido hasta la presente fecha este tipo de mutantes mce.

Descripción de la invención La presente invención se refiere en primer lugar a la obtención, conservación y uso de una cepa de M. a. paratuberculosis mce mutante natural como material de referencia para validar, estandarizar y llevar a cabo ensayos de virulencia y patogenia. La nueva cepa ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edificio de Investigación, 46100 Burjassot (Valencia) donde le ha sido asignado el número de depósito provisional 7530.

Con el término "cepa mce mutante natural" en la presente invención se hace referencia a todas aquellas cepas de M.

a. paratuberculosis en cuyo genoma se ha producido una deleción de 16, 3 Kb sin intervención alguna de la ingeniería genética. Esta deleción está constituida por 19 marcos de lectura abiertos (ORF) consecutivos (MAP0108-MAP0126) entre los cuales se encuentra comprendido el operón mce7 (MAP0108-MAP0113) , genes de las familias PE/PPE (de la presencia de motivos prolina-ácido glutámico y prolina-prolina-ácido glutámico respectivamente) (MAP0122-MAP0124) y un regulador transcripcional (MAP0116) entre otros.

La cepa de M. a. paratuberculosis CECT 7530, objeto de la presente invención, fue obtenida de un rebaño de cabras de la raza de Guadarrama que presentaba una forma paucibacilar de la enfermedad de Johne o paratuberculosis (caracterizada por presentar una carga bacteriana baja en el interior de los macrófagos) . En este rebaño únicamente se aisló la cepa de M. a. paratuberculosis mce mutante natural objeto de la patente (infección monoclonal) , por lo que el rebaño infectado a su vez presentaba una protección natural frente a la enfermedad originada por otras cepas de M.

a. paratuberculosis. Sin embargo, esta cepa delecionada en genes de virulencia mantenía su capacidad inmunógena en el citado rebaño. M. a. paratuberculosis se caracteriza por ser un patógeno intracelular y por lo tanto, el desarrollo de vacunas vivas atenuadas (no registradas actualmente en el mercado) sería importante para ayudar al control y la erradicación de esta enfermedad.

Por lo tanto,... [Seguir leyendo]

1. Cepa de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis de tipo II mutante para genes de entrada celular y virulencia: mce (MAP0108-MAP0113) y PE/PPE (MAP0122-MAP0124) .

2. Uso de la cepa de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis CECT 7530 en ensayos de invasión en líneas celulares como referencia para estudios de invasión y patogenicidad in vivo e in vitro.

3. Uso de la cepa de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis CECT 7530 en el diseño de nuevos microarrays para su aplicación en estudios de hibridación genómica comparada (HGC) .

4. Uso de la cepa de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis CECT 7530 como sujeto de trabajo para la obtención de nuevas cepas vacunales vivas atenuadas para la enfermedad de Johne o paratuberculosis.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad Complutense de Madrid <120> Cepa de Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis tipo II y aplicaciones.

<160> 7

<210> 1

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 4

<210> 5

<211> 690

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis CECT 7530

<400> 5

<210> 6

<211> 688

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis MI05/00483-2

<400> 6

<210> 7

<211> 648

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis MI05/00484-2

<400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 9

<210> 10

<211> 19

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis <400> 11

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200901635

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 23.07.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N1/20 (2006.01) C12R1/325 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

16. 170, ISSN: 0022-2615, todo el documento. 1-4 A GIOFFRE, A. et al., 'Mutation in mce operons attenuates Mycobacterium tuberculosis virulence', MICROBES AND INFECTION, 2005, Vol. 7, No. 3, página.

32. 334, ISSN: 1286-4579, todo el documento. 1-4 A WO 99/10475 A2 (CONNAUGHT LAB.) , todo el documento. 1-4 A JOSHI, SM. et al., 'Characterization of mycobacterial virulence genes through genetic interaction mapping', PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA, 2006, Vol.103, No. 31, páginas 11760-11765, ISSN: 0027-8424, todo el documento. 1-4 A CASALI, N. et al., 'A phylogenomic analysis of the Actinomycetales mce operons', BMC GENOMICS, 2007, Vol. 8, página 60, ISSN: 1471-2164, todo el documento. 1-4 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 06.04.2011 Examinador J. Vizán Arroyo Página 1/5

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200901635

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 23.07.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N1/20 (2006.01) C12R1/325 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200901635

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, C12R Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, BIOSIS, MEDLINE

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200901635

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 06.04.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200901635

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

16. 70. 2008 D02 Gioffre, A. et al., Microbes Infect., (2005) , 7 (3) .

32. 34. 2005 D03 WO 99/10475 A2 (CONNAUGHT LAB.) 04.03.1999 D04 Joshi, SM. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., (2006) , 103 (31) : 11760-5. 2006 D05 Casali, N. et al., BMC Genomics, (2007) , 8: 60. 2007 D06 Li, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., (2005) , 102 (35) : 12344-9. 2005

En D1-D4 se describen diferentes estirpes atenuadas de Mycobacterium tuberculosis.

En D5 se analizan los operones mce en Actinomycetales.

En D6 se divulga la secuencia completa del genoma de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración 1. NOVEDAD (Art. 4.1. y Art. 6.1. de la Ley de Patentes) y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 4.1. y Art. 8.1. de la Ley de Patentes) .

1.1. Reivindicación independiente 1

El objeto de la reivindicación 1 consiste en una cepa mutante de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis que se caracteriza básicamente porque está afectada en los genes mce (MAP0108-MAP0113) y PE/PPE (MAP0122-MAP0124) . En el estado de la técnica más próximo, constituido por los documentos D1-D6, no se ha divulgado ningún mutante atenuado de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis que comparta las mismas características técnicas del mutante de la invención. Además, la obtención de dicho mutante no se deduce de una manera obvia combinando la información contenida en D1-D6. Sobre la base de lo expuesto anteriormente, se consideran también nuevos e inventivos los usos de las reivindicaciones 1-4.

1.2. La presente solicitud satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones 1-4 es nuevo y tiene actividad inventiva de acuerdo con los Arts. 6.1. y 8.1. de la Ley de Patentes.

Informe del Estado de la Técnica Página 5/5