CEPA CECT 7462 DE BACILLUS PUMILUS Y MÉTODO PARA INCREMENTAR SUS EFECTOS ENTOMOPATÓGENOS.

Cepa CECT 7462 de Bacillus pumilus y método para incrementar sus efectos entomopatógenos. La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, específicamente a una nueva cepa bacteriana de Bacillus pumilus (CECT 7462 o B. pumilus TCC), además de a un método para incrementar sus efectos entomopatógenos al someterla a exposiciones a temperaturas inferiores a su temperatura óptima de crecimiento. Además se refiere a composiciones que incluyan la cepa original o ya tratada por el método de la invención, y/o sus estructuras cristalinas, y a sus usos para el control biológico de plagas o producción de bioinsecticidas. También se refiere a cualquier plásmido obtenible a partir de la cepa que contenga secuencias nucleotídicas, o bien a las propias secuencias, que den lugar a proteínas entomopatógenas, así como al uso de la cepa para la producción de enzimas de interés industrial. Estado de la técnica anterior Ceratitis capitata o mosca de la fruta del Mediterráneo, constituye una de las plagas más extendidas a nivel mundial, y es considerada una de las plagas más destructivas en frutas y verduras. Esta plaga genera la pérdida de cosechas enteras de productos de elevado interés agroalimentario. Debido a ello, a nivel internacional, se ha desarrollado legislación en torno a los procedimientos de control de los productos provenientes de países que sufren esta plaga. Uno de los mecanismos que se han postulado para evitar la expansión de la plaga es el sometimiento a cuarentena a los productos cuyo origen se encuentra en países con este problema. Estos periodos de cuarentena generan en muchas ocasiones grandes pérdidas económicas. Además de la elevada destructividad de la plaga de C. capitata, este organismo presenta dificultades para su control. Esto se debe fundamentalmente a que los métodos existentes no son totalmente efectivos. La mayoría de los métodos llevados a cabo se basan en el uso de compuestos químicos que no permiten un control de la plaga que minimice las perdidas económicas, sino que simplemente provocan una pequeña reducción de las mismas sin llegar a ser totalmente efectivos en su control. Además el uso de compuestos químicos de síntesis lleva aparejado, en multitud de casos, la posibilidad de producir algún problema de impacto ambiental y fenómenos de resistencia de insectos. Estos tratamientos químicos se realizan fundamentalmente de dos formas, bien mediante la fumigación aérea de los cultivos con la consiguiente inespecificidad del tratamiento y su dificultad de alcanzar todas las áreas del mismo, o bien mediante el uso de insecticidas para el tratamiento del suelo. Ambos tratamientos presentan como dificultad añadida la inespecificidad de su acción con respecto al organismo a erradicar, produciendo daño sobre especies que pueden no tener ningún efecto nocivo sobre los cultivos, y que son esenciales para mantener el equilibrio ecológico. Otra desventaja que presentan estos tratamientos con productos químicos es la aparición de resistencias en las poblaciones sobre las que se aplica. En la actualidad es fácil encontrar poblaciones de insectos con una mayor tolerancia a altas concentraciones de insecticidas de la que presentaban antes del uso de estos compuestos sobre los cultivos. Esto se observa por ejemplo en poblaciones de C. capitata recogidas en lugares donde se han realizado tratamientos con el insecticida organofosforado Malatión. Los individuos de poblaciones de zonas tratadas son entre 6 y 201 veces más resistentes que ejemplares de laboratorio, y entre 2 y 30 veces más resistentes que ejemplares recogidos en campos donde no se ha usado este insecticida (Magaña et al. 2007. J. Econ. Entomol.; 100: 1836-1843). Debido a estos problemas que presentan los insecticidas de síntesis, a nivel internacional, cada vez se restringe más su uso. Un claro ejemplo es la eliminación del insecticida Malatión por parte de la Unión Europea, en verano de 2007, de la lista de elementos autorizados para el control de plagas. Este insecticida organofosforado era, en ese momento, el compuesto más utilizado para el control de la plaga de C. capitata. Estas restricciones hacen por lo tanto cada vez más complejo el control de esta plaga por parte de los agricultores. Para tratar de solucionar la aparición de plagas en cultivos sin la utilización de compuestos químicos, se han realizado muchas aproximaciones en lo que se conoce con el nombre de control biológico. Una estrategia seguida ha sido la introducción en el hábitat de individuos estériles que evitasen la reproducción y propagación del organismo que representa una plaga. Esta aproximación permite el control sobre la población mediante una reducción del tamaño poblacional de la especie problema, pero normalmente va acompañado de otros sistemas de control para la eliminación de la plaga. Otra de las soluciones que se han puesto en marcha para el control biológico de plagas, es el uso de organismos naturales con actividad entomopatógena. Uno de los ejemplos más claros de este desarrollo es el organismo Bacillus thuringiensis, ampliamente estudiado para el control de plagas de ciertos insectos (Roh et al. 2007. J Microbiol Biotechnol.; 17:547-559). Para este control se está utilizando tanto el microorganismo completo como partes del mismo (normalmente las proteínas Cry o los cristales que forman, o las proteínas Cyt) tanto de forma independiente, como en composiciones que los incluyan (WO2006042404). Existe por tanto una necesidad de controlar la población de C. capitata en cultivos debido a los grandes perjuicios económicos que genera. Este control se ha de realizar de forma que se resuelvan las limitaciones y los inconvenientes que generan los actuales controles químicos de la plaga. 2 Descripción de la invención ES 2 351 142 A1 La presente invención se refiere a una nueva cepa de Bacillus pumilus, así como a un método para aumentar de forma significativa sus efectos entomopatógenos y las cepas así obtenidas. También se refiere a una composición que contenga la cepa original, o ya tratada por el método de la invención, y/o sus estructuras cristalinas para su uso como bioinsecticida o para el control de plagas. También se refiere a cualquier plásmido que codifique secuencias, o bien a las propias secuencias, que den lugar a proteínas entomopatógenas obtenibles a partir de la cepa, tratada o no, y al uso de la cepa para la producción de enzimas de interés industrial. El género Bacillus es reconocido como un grupo de agentes potenciales para el control de poblaciones de insectos debido a los efectos tóxicos que presentan muchos de sus representantes sobre diversas especies de insectos. En la presente invención se analiza inicialmente la toxicidad de varias cepas de la especie B. pumilus sobre los individuos de la Mosca de la fruta del Mediterráneo (C. capitata). Mediante estos estudios se demuestra que existe una leve toxicidad de las diversas cepas estudiadas sobre los individuos de dicha especie. Esta toxicidad es similar por parte de todas las cepas cuando se suministran a larvas de C. capitata junto a la dieta de forma directa tras su cultivo. Sorprendentemente, cuando estas cepas se mantienen 96 horas a 4ºC mezcladas con la dieta de las larvas de C. capitata, se produce un aumento de hasta un 70% en la muerte inducida en dichas larvas por parte de la cepa CECT 7462 (o Bacillus pumilus TCC). Por su parte, el resto de las cepas no presentan efectos significativos en su toxicidad sobre C. capitata, y mantienen o aumentan muy levemente la toxicidad mostrada sin el pretratamiento con frío. La cepa CECT 7462 de la presente invención, por lo tanto, puede ser utilizada para controlar plagas de la mosca de la fruta del Mediterráneo. El uso de cepas naturales con alta actividad entomopatógena, como ocurre con la cepa de la presente invención, contribuye al correcto desarrollo de los cultivos, evitando las pérdidas producidas por la plaga, de forma que se ayuda al desarrollo agronómico de las regiones que las sufren. Además, su uso permite una mayor disponibilidad de estos recursos alimentarios para la población. Por ello, el desarrollo y uso de estos organismos representa una buena opción de futuro para el desarrollo de zonas agrícolas. En este sentido, un primer aspecto de la presente invención es una cepa bacteriana, la cepa CECT 7462 de B. pumilus clasificada por comparación de la secuencia de RNA 16S con las existentes en la base de datos de secuencias genéticas del Nacional Institute of Health de Estados Unidos (NIH), es decir, de la base de datos GenBank. Se trata de un bacilo esporulante Gram positivo cuya designación taxonómica propuesta incluye la cepa CECT 7462 dentro del reino Eubacteria, phylum Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género Bacillus, especie B. pumilus. La cepa CECT 7462 puede ser cultivada aunque... [Seguir leyendo]

2. Composición que comprende la cepa bacteriana según la reivindicación 1. 3. Método para incrementar la patogenicidad de la cepa CECT 7462 de B. pumilus que comprende exponer la cepa a temperaturas inferiores a 25ºC. 4. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 3 donde la exposición se realiza a temperaturas inferiores a 15ºC. 5. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 4 donde la exposición se realiza a temperaturas iguales o inferiores a 4ºC. 6. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 5 donde la exposición se realiza a temperaturas inferiores a -8ºC. 7. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 6 donde la exposición se realiza a temperaturas iguales o inferiores a -20ºC. 8. Método para incrementar la patogenicidad de la cepa CECT 7462 de B. pumilus según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 donde la exposición se realiza entre 2ºC y 6ºC. 9. Método para incrementar la patogenicidad de la cepa CECT 7462 de B. pumilus según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde la exposición se realiza entre -18ºC y -22ºC. 10. Método para incrementar la patogenicidad según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 24 horas. 11. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 10 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 48 horas. 12. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 11 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 96 horas. 13. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 12 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 132 horas. 14. Método para incrementar la patogenicidad según la reivindicación 13 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 168 horas. 15. Cepa bacteriana obtenible a partir de la cepa CECT 7462 por el método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14. 16. Estructuras cristalinas obtenibles a partir de la cepa según la reivindicación 15. 17. Composición que comprende la cepa bacteriana o las estructuras cristalinas según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16. 18. Uso de la cepa bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 15 para el control biológico de plagas. 19. Uso de las estructuras cristalinas según la reivindicación 16 para el control biológico de plagas. 20. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 17 para el control biológico de plagas. 21. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde la plaga es de organismos pertenecientes a alguno de los órdenes de la lista que comprende: Lepidoptera, Coleóptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera o Diptera. 22. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición según la reivindicación 21, donde la plaga es de organismos pertenecientes al orden Diptera. 23. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición según la reivindicación 22, donde la plaga es de mosca de la fruta del Mediterráneo (C. capitata). 11 ES 2 351 142 A1 24. Uso de la cepa bacteriana o la composición que la comprende según cualquiera de reivindicaciones 1 ó 2, para la producción de bioinsecticidas. 25. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición según cualquiera de reivindicaciones 15 a 17, para la producción de bioinsecticidas. 26. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición según la reivindicación 25, donde el bioinsecticida actúa sobre al menos un organismos perteneciente a alguno de los órdenes de la lista comprende: Lepidoptera, Coleóptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera o Diptera. 27. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición según la reivindicación 26, donde el organismo sobre el que actúa es del orden Diptera. 28. Uso de la cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de la composición según la reivindicación 27, donde el organismo del orden Díptera es la mosca de la fruta del Mediterráneo (C. capitata). 29. Uso de la cepa bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 15 para la producción de enzimas. 30. Uso de la cepa bacteriana según la reivindicación 29 donde la enzima es una proteasa o la catalasa. 12 ES 2 351 142 A1 13 ES 2 351 142 A1 14 ES 2 351 142 A1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA