CELULASA TOLERANTE A LOS TENSIOACTIVOS Y PROCEDIMIENTO PARA CONVERTIR LA MISMA.

Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento para convertir la misma Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para modificar el extremo N terminal de una proteína que tiene actividad de endoglucanasa (en especial, una celulasa perteneciente a la familia 45 y que tiene actividad de endoglucanasa) a ácido piroglutámico, para convertir la proteína en una celulasa con actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña, y está relacionada con la celulasa. Antecedentes de la técnica Se dice que la biomasa de celulosa es el recurso más abundante entre los recursos naturales, y por lo tanto en varios campos resulta deseable una aplicación eficiente de los sistemas de celulasas que descomponen la biomasa de celulosa. En este proceso de desarrollo, se han purificado y caracterizado varias celulasas, y además se han clonado diversos genes de celulasa, que se han clasificado en familias mediante el análisis de la homología de secuencias (véase referencia no relacionada con patentes 1). En otro aspecto, las celulasas se utilizan basándose en sus propiedades, en diversos campos industriales, en particular en el campo de procesamiento de tejidos. Por ejemplo, se lleva a cabo un tratamiento con celulasa para mejorar el tacto y/o el aspecto de tejidos que contienen celulosa, o para un biolavado que imparte un aspecto de lavado a la piedra a un tejido que contiene celulosa coloreado, proporcionando por consiguiente al tejido variaciones de color localizadas. Además, en el procedimiento para fabricar liocel, la celulasa se usa para retirar la pelusa generada durante el procedimiento de la superficie del tejido. Al respecto, el liocel es un tejido de celulosa regenerado derivado de la pulpa de madera, que recientemente ha atraído la atención por sus propiedades (tales como la alta resistencia o la absorción de agua) y como un procedimiento de producción que provoca menos polución ambiental. Hasta ahora, se ha considerado que la celulasa decompone la celulosa mediante el efecto colaborativo de varias enzimas, es decir, el efecto sinérgico. El grupo de celulasas que consiste en varias enzimas contiene enzimas que tienen propiedades inadecuadas para el campo del procesamiento de tejidos (tales como una enzima que disminuye la resistencia de la fibra). Por consiguiente, se ha llevado a cabo un intento para separar componentes enzimáticos adecuados para el procesamiento de tejidos del grupo de las celulasas, y para producir los componentes enzimáticos, utilizando técnicas de separación de proteínas y/o técnicas de ingeniería genética. En particular, se han sometido a un estudio serio las celulasas derivadas de microorganismos que pertenecen a los hongos filamentosos tales como el género Trichoderma o el género Humicola. Por ejemplo, como componentes de celulasa, se aislaron CBH I, EG V (véase referencia de patente 1), NCE2, NCE4 y NCE5 en el género Humicola, y CBH I, CBH II, EG II y EG III en el género Trichoderma, y de este modo, se puede producir las preparaciones de celulasa que contienen como componentes principales uno o más componentes de celulasa específicos apropiados para cada propósito mediante la preparación de enzimas sobreexpresadas o enzimas monocomponentes usando técnicas de ingeniería genética. Además, se ha aclarado que las celulasas que pertenecen a la familia 45, tales como NCE4 (véase referencia de patente 2), NCE5 (véase referencia de patente 3), RCE1 (véase referencia de patente 4) o STCE1 (véase Solicitud Internacional Nº PCT/JP2004/15733), son muy útiles en los campos anteriores. En otro aspecto más, cuando se usan las celulasas como un detergente para la ropa, no solamente se desea una mejora cuantitativa de los componentes de celulasa usados sino también una cualitativa. Más particularmente, un detergente para la ropa contiene diversos tensioactivos, y una disolución obtenida mediante la solubilización del detergente para la ropa en agua es alcalina (pH 10 a pH 11). Por consiguiente, es necesario que las celulasas contenidas en un detergente para la ropa sean resistentes a diversos tensioactivos, en condiciones alcalinas. Como un informe en el que una se suprime la reducción de la actividad en presencia de un tensioactivo, Otzen, D. E. y col. informaron que cuando se introdujo una mutación en la secuencia interna de aminoácidos de Cel45 derivada de Humicola insolens, la actividad de la misma a pH 7 en presencia de benceno sulfonato de alquilo lineal (LAS) era aproximadamente 3,3 veces superior a la del tipo natural (véase referencia no relacionada con patentes 2). Sin embargo, se encontró que la supresión de la reducción de la actividad en presencia del tensioactivo, proporcionada por la mutación, está limitada a Cel45 o a sus proteínas homólogas, y que no es aplicable a las endoglucanasas pertenecientes a la familia 45 que tienen baja homología con Cel45. (referencia de patente 1) Publicación Internacional WO91/17243. (referencia de patente 2) Publicación Internacional WO98/0366. (referencia de patente 3) Publicación Internacional WO01/90375. (referencia de patente 4) Publicación Internacional WO00/24879. (referencia no relacionada con patentes 1) Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695-696 (1996). 2 E04820192 16-11-2011   (referencia no relacionada con patentes 2) Daniel E. Otzen, Lars Christiansen, Martin Schulein. A comparative study of the unfolding of the endoglucanase Cel45 from Humicola insolens in denaturant and surfactant. Protein Sci. 8: 1878-1887 (1999). El documento WO 94/07998 se refiere a una variante de celulosa de una celulosa original que comprende un dominio de unión a celulosa, un dominio catalíticamente activo y una región que une los dos dominios mencionados. Para mejorar las propiedades de la variante de celulosa, uno o más restos de aminoácidos neutros en la superficie del dominio catalíticamente activo están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos cargados negativamente, o uno o más restos de aminoácidos cargados positivamente en la superficie del dominio catalíticamente activo están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos neutros o cargados negativamente. Además, uno o más restos de aminoácidos hidrófobos están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos no hidrófobos, o en el que uno o más restos de aminoácidos están sustituidos por prolina. J. Mol. Biol. (1997) 272, 383-397 describe la estructura cristalina del dominio catalítico central de la endoglucanasa I de Trichoderma reesei y una comparación con enzimas relacionadas. Un objeto de la presente invención es para proporcionar un procedimiento para convertir una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa (en particular, una proteína perteneciente a la familia 45 y que tiene una actividad de endoglucanasa) en una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; un vector que se utiliza en el procedimiento; una proteína que tiene una actividad de endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; y un polinucleótido que codifique la misma. Otro objeto de la presente invención es proporcionar, utilizando lo anterior, un microorganismo que produce de manera eficiente una proteína útil como una enzima para el lavado de ropa. Medios para solucionar el problema Los presentes inventores realizaron estudios intensivos, y como resultado, encontraron que las proteínas en las que se añadió ácido piroglutámico (a continuación denominado algunas veces pQ en el presente documento) o un péptido que contenía pQ al extremo N terminal de cada proteína perteneciente a la familia 45 y que tenía una endoglucanasa, es decir, celulasas con adición en el extremo N terminal, tenían una actividad de endoglucanasa que no presentaba una reducción significativa de la actividad en presencia de un tensioactivo, en comparación con las celulasas de tipo natural. La característica de que se mantenga una actividad de endoglucanasa alta en presencia de un agente tensioactivo aniónico es particularmente útil en el caso de enzimas para el lavado de ropa, pero no se conoce una celulasa de tal tipo. Además, no se ha informado que las funciones inherentes a una enzima puedan mantenerse en presencia de un tensioactivo por medio de la adición a la misma de ácido piroglutámico o de un péptido que lo contenga. En otro aspecto de la presente invención, con respecto a todas las celulasas en las que el aminoácido N terminal no está protegido y es deseable el mantenimiento de la actividad en presencia de un agente tensioactivo, resulta posible, mediante la adición a la celulasa de ácido piroglutámico o de un péptido que lo contiene, suprimir la reducción de la actividad en presencia de un tensioactivo. Las... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para suprimir una reducción en la actividad de endoglucanasa en presencia de un tensioactivo, caracterizado por la modificación de una proteína que tiene la actividad de endoglucanasa, en la que el aminoácido N terminal es diferente de ácido piroglutámico, a una proteína que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la modificación se lleva a cabo añadiendo ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, al extremo N terminal de la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico, en el que el aminoácido que se puede convertir en ácido piroglutámico se selecciona de ácido glutámico y glutamina. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la modificación se lleva a cabo sustituyendo el aminoácido N terminal o una región N terminal de la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el aminoácido N terminal es diferente de ácido piroglutámico por ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, o un péptido que tiene el extremo N terminal de ácido piroglutámico o un aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico, en el que el aminoácido que puede convertirse en ácido piroglutámico se selecciona de ácido glutámico y glutamina. 4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína que tiene la actividad de endoglucanasa en la que el extremo N terminal es un aminoácido diferente de ácido piroglutámico es una celulasa perteneciente a la familia 45. 5. Una proteína seleccionada del grupo que consiste en: (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, en la que el extremo N terminal es ácido piroglutámico; (b) una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el extremo N terminal es ácido piroglutámico y en la que se han eliminado, sustituido, insertado o añadido de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, y que tiene una actividad de endoglucanasa; y (c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº 2, 4, 38 o 40, en la que el extremo N terminal es ácido piroglutámico y que tiene una actividad de endoglucanasa. 56 E04820192 16-11-2011   57 E04820192 16-11-2011   58 E04820192 16-11-2011