Células troncales hemotopoyéticas y procedimientos de tratamiento de las enfermedades oculares noeovasculares con las mismas.

Utilización de una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea que comprende las células progenitoras endoteliales para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad ocular en un paciente en la que el medicamento es inyectado por vía intravítrea en un ojo del paciente en una cantidad suficiente para detener la enfermedad

Células troncales hematopoyéticas y procedimientos de tratamiento de las enfermedades oculares neovasculares con las mismas.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la utilización de células troncales hematopoyéticas negativas para el linaje (HSC Lin-) derivadas de la médula ósea para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad ocular en un paciente. La invención se refiere asimismo a las HSC Lin - transfectadas y a su utilización para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la angiogénesis retiniana en el ojo de un paciente y para el tratamiento de las enfermedades neovasculares retinianas en un paciente.

Antecedentes de la invención La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y la retinopatía diabética (RD) son las causas principales de la pérdida visual en las naciones industrializadas y lo son como consecuencia de una neovascularización retiniana anormal. Debido a que la retina está constituida por capas bien definidas de elementos vasculares, gliales y neuronales, las perturbaciones relativamente pequeñas tales como las apreciadas en la proliferación vascular o los edemas pueden conducir a una pérdida significativa de la función visual. Las degeneraciones retinianas heredadas, tales como la retinitis pigmentaria (RP) , están asimismo asociadas con anormalidades vasculares, tales como la atrofia vascular y la estenosis arteriolar. Aunque se ha progresado de manera significativa en la identificación de los factores que promueven e inhiben la angiogénesis, no se dispone en la actualidad de ningún tratamiento para tratar de manera específica la enfermedad vascular ocular.

Durante muchos años ha resultado conocido que existe una población de células troncales en la circulación de un adulto normal y la médula ósea. Pueden diferenciarse diferentes subpoblaciones de estas células en los linajes negativos para linaje (Lin -) no hematopoyéticos o positivos para linaje hematopoyéticos (Lin+) . Además, se ha demostrado recientemente que la población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje (HSC) contiene células progenitoras endoteliales (EPC) que pueden formar vasos sanguíneos in vitro e in vivo, (ver Ashara et al. Science 2175, 964-7 (1997) ) . Estas células pueden participar en la angiogénesis posnatal patológica y normal (ver Ly den et al. Nat. Med. 7, 1194-201 (2001) ; Kalka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3422-7 (2000) ; y Kocher et al. Nat. Med. 7, 430-6 (2001) ) así como diferenciarse en una variedad de tipos de células no endoteliales que comprenden hepatocitos (ver Lagasse et al. Nat. Med. 6, 1229-34 (2000) ) , microglia (ver Priller et al. Nat. Med. 7, 1356-61 (2002) ) , cardiomiocitos (ver Orlic et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10344-9 (2001) ) y epitelio (ver Ly den et al. Nat. Med. 7, 1194-201 (2001) ) . Aunque estas células han sido utilizadas en varios modelos experimentales de angiogénesis, el mecanismo de dianización de EPC a la neovasculatura no es conocido y no se ha identificado ninguna estrategia que aumente de manera efectiva el número de células que contribuyen a una vasculatura particular.

Grant et al describen que las células troncales hematopoyéticas adultas proporcionan una actividad de los hemangioblastos funcional durante la neovascularización (ver Grant et al. Nat. Med. 8, 607-612 (2002) ) . Otani et al. PNAS 99, 178-183 (2002) ) .

Sumario de la invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona la utilización de una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea que comprende las células progenitoras endoteliales (EPC; conocidas asimismo como células precursoras endoteliales) para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad ocular en un paciente en la que el medicamento es administrado mediante inyección intravítrea en un ojo del paciente en una cantidad suficiente para detener la enfermedad.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje transfectada que comprende una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, que comprende las células progenitoras endoteliales en la que por lo menos 50% de las células comprenden los marcadores celulares CD31 y c-kit, siendo dicha población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, transfectada con un gen que codifica un péptido útil terapéuticamente en la que el péptido útil terapéuticamente es un péptido antiangiogénico seleccionado de entre el grupo constituido por fragmento T1 de TrpRS y fragmento T2 de TrpRS.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona la utilización de una población de células troncales transfectadas que comprende una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, que comprende células progenitoras endoteliales en la que por lo menos 50% de las células comprenden los marcadores celulares CD31 y c-kit para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición de la angiogénesis retiniana en el ojo de un paciente que requiera la inhibición de la angiogénesis

retiniana en la que dicha población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, es transfectada con un gen que codifica un péptido útil terapéuticamente y el medicamento es inyectado por vía intravítrea en el ojo del paciente.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona la utilización de una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje transfectada obtenida a partir de la médula ósea en la que la población de células troncales es transfectada con un gen útil terapéuticamente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades neovasculares retinianas en un paciente, en la que el medicamento es inyectado por vía intravítrea en el ojo del paciente.

Las formas de realización preferidas de los aspectos de la invención son expuestas en las reivindicaciones 2 a 8, 11, 12, y 14 a 16.

Las EPC en las poblaciones de HSC negativas para linaje descritas en la presente memoria son incorporadas ampliamente en los vasos retinianos en desarrollo y permanecen estables incorporadas en la neovasculatura del ojo. Las poblaciones de HSC negativas para linaje descritas en la presente memoria pueden ser utilizadas para el rescate y la estabilización de la vasculatura retiniana en degeneración en los mamíferos. En una forma de realización de las poblaciones de HSC Lin - descritas en la presente memoria, las células son transfectadas con un gen útil terapéuticamente. Las células transfectadas pueden dianizar selectivamente la neovasculatura e inhibir la formación de nuevos vasos sin afectar a los vasos ya establecidos a través de una forma de terapia génica basada en células. Las células de las poblaciones de HSC negativas para linaje descritas en la presente memoria que han sido transfectadas con un gen que codifica los péptidos inhibidores de la angiogénesis resultan útiles para la modulación del crecimiento de los vasos sanguíneos anormal en enfermedades como ARMD, DR y determinadas degeneraciones retinianas asociadas a una vasculatura anormal.

Una ventaja particular de los tratamientos oculares con la población de HSC Lin - descrita en la presente memoria es un efecto de rescate neurotrófico y vasculotrófico apreciado en los ojos tratados por vía intravítrea con las HSC Lin -. Las neuronas y los fotorreceptores retinianos son preservados y la función visual es mantenida en los ojos tratados con las HSC Lin - aisladas.

Las poblaciones de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje que contienen células progenitoras endoteliales son aisladas de la médula ósea, preferentemente la médula ósea adulta.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 (a y b) representa diagramas esquemáticos del desarrollo de la retina de ratón. (a) Desarrollo del plexo primario. (b) Segunda fase de la formación de los vasos retinianos. GCL, capa de células ganglionares.; IPL, capa del plexo interno; INL, capa nuclear interna; OPL, capa del plexo externo; ONL, capa nuclear externa; RPE, epitelio pigmentario de la retina; ON, nervio óptico; P, periferia.

La figura 1 representa la caracterización citométrica de flujo de las células separadas HSC... [Seguir leyendo]

1. Utilización de una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea que comprende las células progenitoras endoteliales para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad ocular en un paciente en la que el medicamento es inyectado por vía intravítrea en un ojo del paciente en una cantidad suficiente para detener la enfermedad.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el número de células troncales resulta eficaz para la reparación del daño retiniano del ojo del paciente, o resulta eficaz para estabilizar la neovasculatura retiniana del ojo del paciente, o resulta eficaz para la maduración de la neovasculatura retiniana del ojo del paciente.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que la población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje es aislada mediante:

(a) la separación de una pluralidad de monocitos de la médula ósea que ha sido extraída de un mamífero;

(b) el marcado de la pluralidad de monocitos con anticuerpos de panel de linaje conjugados con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119; y

(c) la extracción de los monocitos que resultaban positivos para linaje para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje que comprende las células progenitoras endoteliales.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que por lo menos 50% de la población aislada de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje comprenden los marcadores celulares CD31 y c-kit.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que la enfermedad ocular es seleccionada de entre el grupo constituido por enfermedad degenerativa retiniana, retinopatía isquémica, hemorragia vascular, fuga vascular, coroidopatía, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, presunta histoplasmosis ocular, retinopatía de prematuridad, anemia depranocítica, y retinitis pigmentaria.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que un número de células inductoras de rescate neurotrófico de una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje, derivadas de la médula ósea de mamífero, aislada, que contiene células progenitoras endoteliales en la que por lo menos 50% de las células troncales comprenden marcadores celulares para CD31 y c-kit es utilizada para la preparación del medicamento, el paciente es un mamífero, la enfermedad ocular es una enfermedad degenerativa retiniana, y el medicamento es administrado a un ojo enfermo del animal.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que la población de células troncales es aislada mediante:

(a) la separación de una pluralidad de monocitos de la médula ósea que ha sido extraída de un mamífero;

(b) el marcado de la pluralidad de monocitos con anticuerpos de panel de linaje conjugados con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119; y

(c) la extracción de los monocitos que son positivos para linaje para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje que comprenden las células progenitoras endoteliales.

8. Utilización según la reivindicación 6, en la que el mamífero es un humano.

9. Población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje transfectada que comprende una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, que comprende las células progenitoras endoteliales en la que por lo menos 50% de las células comprenden los marcadores celulares CD31 y c-kit, siendo dicha población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, transfectada con un gen que codifica un péptido útil terapéuticamente en la que el péptido útil terapéuticamente es un péptido antiangiogénico seleccionado de entre el grupo constituido por el fragmento T1 de TrpRS y el fragmento T2 de TrpRS.

10. Utilización de una población de células troncales transfectada que comprende una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, que comprende las células progenitoras endoteliales en la que por lo menos 50% de las células comprenden los marcadores celulares CD31 y c-kit para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la angiogénesis retiniana en el ojo de un paciente que requiera la inhibición angiogénica retiniana en la que dicha población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje derivadas de la médula ósea, de mamífero, es transfectada con un gen que codifica un péptido útil terapéuticamente y el medicamento es inyectado por vía intravítrea en el ojo del paciente.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que la población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje transfectada es preparada mediante:

(a) la separación de una pluralidad de monocitos de la médula ósea que ha sido extraída de un mamífero;

(b) el marcado de la pluralidad de monocitos con anticuerpos de panel de linaje conjugados con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119; y (c) la extracción de los monocitos que eran positivos para linaje para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 a partir de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje que comprende las células progenitoras endoteliales.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que por lo menos 75% de la población aislada de las células 15 troncales hematopoyéticas negativas para linaje comprenden el marcador celular CD31.

13. Utilización de una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje transfectada derivada de la médula ósea en la que la población de células troncales ha sido transfectada con un gen útil terapéuticamente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las enfermedades neovasculares retinianas en un paciente, en la que el medicamento es inyectado por vía intravítrea en el ojo del paciente.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje transfectada es preparada mediante:

(a) la separación de una pluralidad de monocitos de la médula ósea que ha sido extraída de un mamífero;

(b) el marcado de la pluralidad de monocitos con anticuerpos de panel de linaje conjugados con biotina para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119; y (c) extraer los monocitos que eran positivos para linaje para CD45, CD3, Ly-6G, CD11 y TER-119 a partir de la pluralidad de monocitos para proporcionar una población de células troncales hematopoyéticas negativas para linaje que comprenden las células progenitoras endoteliales.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que por lo menos 50% de la población aislada de células troncales 35 hematopoyéticas negativas para linaje comprenden los marcadores celulares CD31 y c-kit.

16. Utilización según la reivindicación 13, en la que el gen resulta útil para inhibir la neovascularización retiniana.