Célula progenitora de megacariocitos de mamífero.

Una composición que comprende una composición sustancialmente pura de células progenitoras de megacariocitos de mamífero monopotentes,

en la que al menos el 80% de las células en dicha composición expresan CD41, CD9 y CD34 y son panel-de linaje, y en la que las células en dicha composición que expresan CD41, CD9 y CD34 y son panel-de linaje dan lugar exclusivamente a colonias de megacariocitos;

y un medio fisiológicamente aceptable.

Célula progenitora de megacariocitos de mamífero ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El sistema hematopoyético comprende poblaciones dinámicas de glóbulos sanguíneos que incluyen eritrocitos, linfocitos, monocitos, células polimorfonucleares, por ejemplo, basófilos, eosinófilos y neutrófilos; y megacariocitos. Todas estas diversas células se derivan del citoblasto hematopoyético pluripotente. A lo largo de una serie de divisiones de células hay una diferenciación de uno de estos linajes. Se cree que, al menos in vivo, después de cada división de células, el potencial de desarrollo de las células hijas es o bien mantenido o bien limitado adicionalmente con respecto al padre, nunca expandido. Por tanto, se observa que los citoblastos pluripotentes dan lugar a células progenitoras comprometidas de múltiple linaje que dan lugar a linajes específicos y finalmente a células maduras. Los cambios coordinados de propiedades celulares que conducen a restricción irreversible del compromiso de linaje pueden ser debidos a activación secuencial o silenciamiento de diversos genes.

Se ha mostrado que la médula ósea de ratón sin fraccionar contiene múltiples tipos de unidades formadoras de colonias (UFC) que incluyen UFC multipotentes para todas las células mieloides (UFC-GEMM o UFC-Mix) , UFC bipotentes para granulocitos y macrófagos (UFC-GM) , para megacariocitos y eritrocitos (UFC-MegE) , además de UFC monopotentes para granulocitos (UFC-G) , macrófagos (UFC-M) , eritrocitos (UFC-E) o megacariocitos (UFC-MK) .

Se han caracterizado individualmente tres poblaciones diferentes de progenitores mieloides: progenitores mieloides comunes (CMP) , progenitores de granulocitos/monocitos (GMP) y progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP) . Las CMP dan lugar a todos los linajes mieloides, mientras que las GMP y MEP dan lugar a células en los linajes de granulocitos/monocitos y megacariocitos/eritrocitos, respectivamente. La capacidad de diferenciación restringida y el compromiso de linaje de estas células se ha demostrado claramente por ensayo tanto en cultivo in vitro como de trasplante in vivo por Akashi y col. (2000) Nature 404, 193-197; y Na Nakorn y col. (2002) J. Clin. Invest. 109, 1579-1585. Si los progenitores monopotentes para cada linaje mieloide existen o no del mismo modo tiene todavía que demostrarse, ya que se han aislado y probado prospectivamente para los potenciales de diferenciación in vitro e in vivo al nivel clónico.

En el linaje megacariocítico se cree ampliamente que las UFC-MK se derivan de progenitores comprometidos con megacariocitos (MKP) monopotentes en la médula ósea. Véase, por ejemplo, Burstein y col. (1979) Blood 54, 169-179; Long y col. (1982) J. Cell. Physio 112, 339-344; Long y col. (1984) J. Clin. Invest. 74, 1686-1692; y Paulus y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4410-4414.

El uso de células progenitoras comprometidas con linaje salva muchos de los problemas que se producirían a partir de la transferencia de células maduras, y proporciona un medio para cribar agentes con actividad altamente específica. Sin embargo, tales células progenitoras deben separarse de otras células hematopoyéticas. La separación requiere identificación de la célula y caracterización de diferencias fenotípicas que pueden utilizarse en un procedimiento de separación. Las células que están dispuestas a manipulación genética son particularmente deseables.

Bibliografía relevante [0006] Se han publicado varios artículos de revisión que tratan el fenotipo de células en linajes hematopoyéticos. El desarrollo global del sistema hematolinfoide se trata en Orkin (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6:597-602. La función de factores de transcripción en la regulación de la diferenciación hematopoyética se trata en Georgopoulos y col. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:155-176; y Singh (1996) Curr. Opin. Immunol. 8:160-165. El fenotipo de citoblastos hematopoyéticos se trata en Morrison & Weissman (1994) Immunity 1, 661-673; Spangrude y col. (1988) Science 241, 58-62; Enver y col. (1998) Blood 92, 348-351; discusión 352; Uchida y col. (1994) Blood 83, 3758-3779; Morrison y col., The aging of hematopoietic stem cells. Nat Med 2, 1011-1016 (1996) .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se proporciona una población de células hematopoyéticas de mamífero sustancialmente enriquecida que se caracteriza como una célula progenitora comprometida con el linaje de megacariocitos, en este documento se denomina en lo sucesivo células MKP. Estas células dan lugar exclusivamente a megacariocitos y plaquetas como se demuestra por su crecimiento y diferenciación in vitro e in vivo. In vivo, las MKP ni tienen actividad formadora de colonias en el bazo ni contribuyen a la hematopoyesis de múltiples linajes a largo plazo, pero dan lugar a plaquetas durante aproximadamente 3 semanas. Las células MKP son útiles en trasplante, para evaluación experimental y como fuente de linaje y productos específicos de célula, incluyendo especies de ARNm útiles en la identificación de genes específicamente expresados en estas células, y como dianas para el descubrimiento de factores o moléculas que pueden afectarlas.

La selección positiva para la expresión de CD9, CD41 y CD34 se usa para separar las células progenitoras comprometidas con megacariocitos de progenitores menos comprometidos y de megacariocitos maduros. Opcionalmente, la población de células también puede seleccionarse negativamente para la expresión de un panel de linaje; Thy-1 (CD90) ; y/o IL-7Ra.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. Identificación de MKP en médula ósea de ratón. A) Análisis de citometría de flujo de médula ósea después de disminuirse las células positivas para linaje con perlas magnéticas. Las puertas de clasificación para MKP se muestran en el panel superior. La frecuencia de MKP se muestra con respecto a las células de la médula ósea nucleadas totales antes de la disminución negativa. El re-análisis después de la primera ronda de clasificación encontró que las MKP era una población limpiamente aislable (panel inferior) . B) Las MKP fueron células similares a mieloblasto sin rasgos característicos de megacariocitos (tinción con Giemsa, aumento original x1000) . C) El análisis del contenido de ADN mostró que las MKP eran células diploides. Después de una incubación de 5 días con SCF y Tpo, en el cultivo se encontraron megacariocitos poliploides (16N) .

FIG. 2. Formación de colonias clonogénicas de megacariocitos. A) Morfología de UFC-MK y UFR-MK típicas derivadas de MKP en el día 10 de cultivo (contraste de fase; aumento original 100x para UFC-MK, 40x para UFR-MK) . B) Megacariocitos maduros de una única colonia (Giemsa; aumento original 200x y 1000x) . C) Lecturas de colonias en el día 10 de progenitores individuales en metilcelulosa que contiene SCF, ligando Flt3, IL-3, IL-11, GM-CSF, Epo y Tpo. Se puntuaron un total de 270 pocillos depositados con un único progenitor. Las CMP dieron lugar a todos los tipos de colonias mieloides con eficiencia de siembra en placa superior al 80%. Las MEP dieron lugar a colonias de tanto megacariocitos como eritroides, mientras que las MKP formaron exclusivamente colonias de megacariocitos.

FIG. 3. Diferenciación in vivo de MKP. A) Histología del bazo en el día 8 (hematoxilina y eosina, aumento original: control y MEP = 200x, MKP = 400x y recuadro = 1000x) . Los ratones se irradiaron mortalmente, luego se inyectaron sin célula (control) , 1000 MKP o 500 MEP. Las MKP dieron lugar a focos microscópicos de megacariocitos (Meg) , mientras que las MEP formaron grandes colonias que sólo estaban constituidas por células eritroides (E) . No se observaron colonias eritroides o de megacariocitos en los animales de control. B) Representaciones de FACS representativas de plaquetas en la sangre periférica de ratones receptores 14 días después de recibir los progenitores purificados de donantes transgénicos para la GFP º-actina. Los glóbulos sanguíneos se seleccionaron primero en la dispersión frontal y la dispersión lateral. Los porcentajes de células GFP+CD61+ en la selección de plaquetas se muestran en los recuadros. C) Las MKP generaron plaquetas in vivo durante 3 semanas. La cinética del injerto funcionante de plaquetas de 3000 MKP fue similar a 10.000 CMP y MEP (líneas de rayas) . A diferencia, 10.000 GMP no generaron plaquetas detectables en ningún momento de tiempo del análisis (línea negra) . El umbral para detectar plaquetas GFP+ en la población completa fue 1 en 100.000.

FIG. 4. Relaciones de linaje entre progenitores mieloides.... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una composición sustancialmente pura de células progenitoras de megacariocitos de mamífero monopotentes, en la que al menos el 80% de las células en dicha composición expresan CD41, CD9 y CD34 y son panel-de linaje, y en la que las células en dicha composición que expresan CD41, CD9 y CD34 y son panel-de linaje dan lugar exclusivamente a colonias de megacariocitos; y un medio fisiológicamente aceptable.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho panel de linaje incluye CD2; CD3; CD4; CD7; CD8; CD10; CD11b; CD14; CD19; CD20; CD56; y glicoforina A (GPA) .

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dichas células progenitoras de megacariocitos, cuando se cultivan en metilcelulosa en presencia de factor de Steel (SLF) , ligando flt-3 (FL) , interleucina (IL) -3, IL-11, GM-CSF, trombopoyetina (Tpo) y eritropoyetina (Epo) , dan lugar a colonias de megacariocitos.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos progenitores de megacariocitos son células de ratón.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que dichas células están genéticamente modificadas para comprender un vector de ADN exógeno.

6. Un procedimiento de enriquecimiento para una composición de células progenitoras de megacariocitos de mamífero monopotentes caracterizadas como CD41+, CD9+, CD34+, comprendiendo el procedimiento:

combinar reactivos que reconocen específicamente CD41, CD9 y CD34 con una muestra de células hematopoyéticas; y seleccionar aquellas células que son CD41+, CD9+, CD34+ para proporcionar una población enriquecida de células que tiene actividad progenitora de megacariocitos que dan lugar exclusivamente a colonias de megacariocitos.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha muestra de células hematopoyéticas es médula ósea.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha muestra de células hematopoyéticas es sangre periférica movilizada.

9. Un procedimiento de cribado de secuencias genéticas específicamente expresadas en células exclusivamente comprometidas con el linaje de megacariocitos, comprendiendo el procedimiento:

aislar ARN de una población de células según la reivindicación 1, generar una sonda a partir de dicho ARN, cribar una población de ácidos nucleicos para la hibridación con dicha sonda.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dichas células son células de ratón.

11. Una población de células progenitoras de megacariocitos monopotentes, en la que al menos el 80% de las células en dicha población se caracterizan como CD41+, CD9+, CD34+; en la que dichas células progenitoras de megacariocitos dan lugar a plaquetas in vivo para su uso en un procedimiento para tratar un receptor de mamífero para proporcionar plaquetas para el mismo.

12. Una población para su uso en un procedimiento según la reivindicación 11, en la que dichas células se administran conjuntamente con trombopoyetina o un mimético de la misma.

13. Un procedimiento de cribado de factores que afectan la trombopoyesis, comprendiendo el procedimiento:

combinar un factor de trombopoyesis candidato con una población de células progenitoras de megacariocitos monopotentes, en el que al menos el 80% de las células en dicha población se caracterizan como CD41+, CD9+, CD34+, y determinar el efecto de dicho agente sobre la formación de megacariocitos y plaquetas.