Casetes de inmunización de ADN de vif atenuados para vacunas genéticas.

Una proteína vif no funcional, atenuada y aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5.

Casetes de inmunización de ADN de vif atenuados para vacunas genéticas

Campo de la invención

La invención se refiere a la preparación y al uso de casetes de inmunización de vif del VIH no funcionales y atenuados como vacunas genéticas para genes patógenos.

Antecedentes de la invención

La vacunación y la inmunización generalmente se refieren a la introducción de un agente no virulento contra el que un sistema inmunitario del individuo puede iniciar una respuesta inmunitaria que luego estará disponible para defender contra la exposición a un patógeno. El sistema inmunitario identifica composiciones y agentes “extraños” invasores principalmente identificando proteínas y otras moléculas grandes que normalmente no están presentes en el individuo. La proteína extraña representa una diana contra la que se hace la respuesta inmunitaria.

El sistema inmunitario puede proporcionar múltiples medios para eliminar dianas que se identifican como extrañas. Estos medios incluyen respuestas humorales y celulares que participan en el reconocimiento y la eliminación de antígenos. Brevemente, la respuesta humoral implica linfocitos B que producen anticuerpos que se unen específicamente a antígenos. Hay dos brazos de la respuesta inmunitaria celular. El primero implica linfocitos T colaboradores que producen citocinas y provocan la participación de células inmunitarias adicionales en la respuesta inmunitaria. El segundo implica linfocitos T citolíticos, también conocidos como linfocitos T citotóxicos (CTL) , que son células que pueden reconocer antígenos y atacar al antígeno, incluyendo la célula o partícula a la está unida.

La vacunación ha sido particularmente responsable de conferir protección inmunitaria contra varios patógenos humanos. En la búsqueda de vacunas seguras y eficaces para inmunizar individuos contra agentes patógenos infecciosos como virus, bacterias y organismos eucariotas infecciosos, hasta la fecha se han empleado varias estrategias. Cada estrategia aspira a alcanzar el objetivo de proteger al individuo contra la infección por patógenos administrando al individuo una proteína diana asociada al patógeno que puede provocar una respuesta inmunitaria. Por tanto, cuando el individuo se expone a un patógeno infeccioso, el sistema inmunitario del individuo puede reconocer la proteína y organizar una defensa eficaz contra la infección. Hay varias estrategias de vacunas para presentar las proteínas de patógeno que incluyen presentar la proteína como parte de un agente no infeccioso o menos infeccioso o como una composición de proteína discreta.

Una estrategia para inmunizar contra infección usa vacunas muertas o inactivadas para presentar las proteínas de patógeno a un sistema inmunitario del individuo. En tales vacunas, el patógeno está tanto muerto como inactivado de otro modo usando medios tales como, por ejemplo, calor o agentes químicos. La administración de patógeno muerto o inactivado a un individuo presenta el patógeno al sistema inmunitario del individuo en una forma no infecciosa y entonces el individuo puede organizar una respuesta inmunitaria contra él. Las vacunas de patógenos muertos o inactivados proporcionan protección generando directamente respuestas inmunitarias de linfocitos T colaboradores y humorales contra los inmunógenos patógenos. Debido a que el patógeno está muerto o inactivado de otra forma, hay poco riesgo de infección.

Otro procedimiento de vacunación contra patógenos es proporcionar una vacuna atenuada. Las vacunas atenuadas son esencialmente vacunas vivas que presentan una infectividad reducida. Las vacunas atenuadas se producen frecuentemente sometiendo a pases varias generaciones del patógeno a través de un huésped permisivo hasta que los agentes de la progenie ya no sean virulentos. Usando una vacuna atenuada, un agente que muestra infectividad limitada puede emplearse para provocar una respuesta inmunitaria contra el patógeno. Manteniendo un cierto nivel de infectividad, la vacuna atenuada produce una infección de bajo nivel y provoca una respuesta inmunitaria más fuerte que las vacunas muertas o inactivadas. Por ejemplo, las vacunas atenuadas vivas, tales como vacunas contra el virus de la poliomielitis y la viruela, estimulan inmunidades de linfocitos T colaboradores, T citotóxicos y humorales protectoras durante su infección no patógena del huésped.

Otros medios de inmunización contra patógenos se proporcionan por medio de vacunas recombinantes. Hay dos tipos de vacunas recombinantes: uno es un patógeno en el que genes específicos son delecionados con el fin de convertir el agente resultante en no virulento. Esencialmente, este tipo de vacuna recombinante es atenuada por diseño y requiere la administración de un agente infeccioso no virulento activo que, tras establecerse por sí mismo en un huésped, produce o hace que se produzcan antígenos usados para provocar la respuesta inmunitaria. El segundo tipo de vacuna recombinante emplea vectores no virulentos infecciosos en los que se inserta el material genético que codifica antígenos diana. Este tipo de vacuna recombinante requiere similarmente la administración de un agente no virulento infeccioso activo que, tras establecerse por sí mismo en un huésped, produce o hace que se produzca el antígeno usado para provocar la respuesta inmunitaria. Tales vacunas emplean esencialmente agentes no virulentos infecciosos para presentar los antígenos de patógeno que luego pueden servir de dianas para una respuesta inmunitaria anti-patógeno. Por ejemplo, el desarrollo de la variolovacuna como sistema de expresión para la vacunación ha simplificado teóricamente la seguridad y el desarrollo de estrategias de vacunación infecciosas con respuestas inmunitarias de linfocitos T más amplias.

Otro procedimiento de inmunización contra la infección usa vacunas de subunidad. Las vacunas de subunidad generalmente consisten en una o más proteínas aisladas derivadas del patógeno. Estas proteínas actúan de antígenos diana contra los que un individuo puede organizar una respuesta inmunitaria. Las proteínas seleccionadas para la vacuna de subunidad son expresadas por el patógeno de manera que tras la infección de un individuo por el patógeno el sistema inmunitario del individuo reconoce el patógeno y organiza una defensa contra él. Debido a que las vacunas de subunidad no son agentes completamente infecciosos, son incapaces de volverse infecciosos. Por tanto, no presentan riesgo de infectividad virulenta no deseable que está asociada a otros tipos de vacunas. Se ha informado que las vacunas de subunidad recombinantes tales como la vacuna del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) estimulan una respuesta inmunitaria de linfocitos T colaboradores y humoral protectora más específica contra un único antígeno. Sin embargo, el uso de esta tecnología para estimular la amplia protección contra diversos patógenos tiene que confirmarse.

La construcción de vacunas eficaces se complica debido a varios factores que incluyen la patobiología del patógeno y las especificidades de la respuesta inmunitaria del huésped. Recientemente se ha puesto a disposición una novedosa herramienta para el entendimiento del componente inmunitario de estas interacciones en forma de inmunización genética o vacunación con ADN. Tang y col., Nature, 1992, 356, 152; Fynan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 11478; Ulmer y col., Science, 1993, 259, 1745; y Wang y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1993, 90, 4156. La capacidad de este enfoque se demostró que producía amplias respuestas inmunitarias contra productos génicos estructurales y enzimáticos del VIH-1 y dio una idea general de una estrategia para el desarrollo de una posible vacuna profiláctica para el VIH-1. Esta estrategia usó múltiples casetes de expresión génica que codificaban gag/po//rev, además de env/rev y inmunógenos de genes accesorios. Los estudios demostraron claramente que roedores y primates pueden inmunizarse satisfactoriamente con genes estructurales y de la envoltura del VIH-1. Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4156 y Wang y col., DNA Cell Biol., 1993, 12,

799. Se necesita una estrategia genética para la construcción de casetes de expresión de inmunógeno a partir de un gen patógeno que pueda aplicarse ampliamente con el fin de usar inmunógenos de ADN contra diversos patógenos.

Los genomas lentivíricos de primates contienen genes que codifican proteínas reguladoras y accesorias novedosas, además de proteínas con funciones estructurales y enzimáticas.... [Seguir leyendo]

1. Una proteína vif no funcional, atenuada y aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vif no funcional atenuada de la reivindicación 1.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 28.

4. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de la reivindicación 1 en un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

5. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la 10 reivindicación 3 en un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

7. Una célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

8. Un anticuerpo purificado específicamente dirigido contra la proteína vif no funcional atenuada de la reivindicación

1.

9. Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3 para su uso en la inmunización de un mamífero contra un virus administrando la molécula de ácido nucleico a células de dicho mamífero, en la que dicha molécula de ácido nucleico se expresa en dichas células.

10. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que dicho virus está seleccionado del grupo que consiste en virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus Visna y virus de la inmunodeficiencia simia.

11. Un plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional, atenuada y aislada de la reivindicación 1.

FIGURA 8A

N13 (SEC ID Nº: 27)

N15 (SEC ID Nº: 28)

N17 (SEC ID Nº: 29)

N22 (SEC ID Nº: 30)

FIGURA 8B

N23 (SEC ID Nº: 31)

N24 (SEC ID Nº: 32)

N26 (SEC ID Nº: 33)

N27 (SEC ID Nº: 34)

FIGURA 8C

N29 (SEC ID Nº: 35)

N30 (SEC ID Nº: 36)

T3 (SEC ID Nº: 37)

T4 (SEC ID Nº: 38)

FIGURA 8D

T35 (SEC ID Nº: 39)

T37 (SEC ID Nº: 40)

T38 (SEC ID Nº: 41)

T39 (SEC ID Nº: 42)

FIGURA 8E

T40 (SEC ID Nº: 43)

T42 (SEC ID Nº: 44)

T43 (SEC ID Nº: 45)

T44 (SEC ID Nº: 46)