Bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina,

que son resistentes a ácido -amino-ß-hidroxivalérico, en donde dichas bacterias contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS un (1) codón de terminación del tipo ámbar y (2) el correspondiente supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipoámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2.

Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina Campo de la invención La invención se refiere a bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del gen rpoS y el correspondiente supresor para el codón de terminación, el supresor ámbar SupE. Esta invención se refiere también a un procedimiento para preparar L-treonina utilizando estas bacterias.

Técnica anterior L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de manera muy particular, en piensos para animales.

Es conocido que los L-aminoácidos se preparan mediante fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Se han buscado siempre mejoras en los métodos de preparación debido a la gran importancia de este procedimiento. Las mejoras en el procedimiento pueden referirse a las medidas tecnológicas de la fermentación tales como, p. ej., agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutricios tales como, p. ej., la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento para obtener la forma de producto, p. ej., mediante cromatografía de intercambio de iones, o las características de comportamiento intrínseco del propio microorganismo.

Para mejorar las características de comportamiento de estos microorganismos, se utilizan los métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De este modo, se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos tales como p. ej., el análogo de treonina, ácido a-amino-º-hidroxivalérico (AHV) , o son auxotróficas para importantes metabolitos reguladores y producen L-aminoácidos tales como p. ej., L-treonina.

Los métodos de la ingeniería de ADN recombinante también se han utilizado durante un cierto número de años para la mejora de la cepa de cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, al multiplicar genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos y someter a ensayo el efecto sobre la producción.

El gen rpoS, que también se conoce bajo el nombre de gen katF, codifica una proteína que se denomina el factor 038

o factor 0S, la proteína 038 o la subunidad 038 o incluso la proteína RpoS. En la bibliografía se encuentran también los siguientes nombres para el gen rpoS, aunque menos habitualmente: abrD, dpeB, appR, sigS, otsX y snrA. El factor 0S, en calidad de una subunidad de ARN-polimerasa, controla la expresión de una amplia diversidad de diferentes grupos de genes (Loewen et al.; Canadian Journal of Microbiology 44 (8) : 707-717 (1998) ) , en donde los mecanismos de regulación son a menudo poco claros.

Datos sobre la secuencia de nucleótidos del gen rpoS o katF se pueden encontrar en Mulvey y Loewen (Nucleic Acids Research 17 (23) : 9979-9991 (1989) ) y en Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997) ) . Datos correspondientes también se pueden encontrar en el Centro Nacional para la Información de Biotectonología (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo los números de acceso X16400 y AE000358. El inicio de la traducción o el codón de iniciación para el gen rpoS se determinó por Loewen et al. (Journal of Bacteriology 175 (7) : 2150-2153 (1993) ) .

Además, se conoce un cierto número de alelos rpoS en cepas de Escherichia coli, por ejemplo en cepas del tipo W3110 (Ivanova et al.; Nucleic Acids Research 20 (20) : 5479-5480 (1992) y Jishage e Ishihama; Journal of Bacteriology 179 (3) : 959-963 (1997) ) .

En el documento WO 01/05939 se demuestra que, después de una desconexión completa del factor 038 al incorporar una deleción en el gen rpoS de un productor de ácido L-glutámico, se mejora la producción de ácido glutámico.

Nagano et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistr y 64 (9) : 2012-2017 (2000) ) informan sobre una cepa W3110 de Escherichia coli y los mutantes W196 productores de L-lisina, conteniendo ambos un alelo rpoS que contiene un codón de terminación ámbar (TAG) en el punto correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína 0 38. La cepa W196 contiene también una mutación en el gen serU que codifica ARNt de L-serina que se denomina supD.

Descripción de la invención Siempre que se mencionen aminoácidos o L-aminoácidos en lo que sigue, estos pretenden cubrir todos los aminoácidos proteinogénicos, con la excepción de L-lisina. Esto significa, en particular, L-treonina, L-isoleucina, Lhomoserina, L-metionina, ácido L-glutámico, L-valina y L-triptófano, en donde se prefiere L-treonina.

"Aminoácidos proteinogénicos" se entiende que son aquellos aminoácidos que son constituyentes de proteínas. Estos incluyen los aminoácidos L-glicina, L-alanina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, L-metionina, L-prolina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-asparagina, L-glutamina, ácido L-aspártico, ácido Lglutámico, L-arginina, L-lisina, L-histidina y L-selenocisteína.

La invención proporciona bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes al ácido a-amino-º-hidroxivalérico (= AHV) y que 1) contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del gen rpoS, y 2) contienen el correspondiente supresor para el codón de terminación, supresor ámbar supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID NO. 2.

Las bacterias proporcionadas por la presente invención, pueden producir L-treonina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Son representantes de la familia Enterobacteriaceae, elegidos de la especie Escherichia coli.

Las bacterias productoras de L-treonina proporcionadas por la presente invención pueden, entre otros, producir opcionalmente L-lisina como un producto secundario, además del L-aminoácido deseado. Bacterias de acuerdo con la invención producen a lo sumo 0 a 40% o 0 a 20%, preferiblemente a lo sumo 0 a 10%, de manera particularmente preferida a lo sumo 0 a 5% de L-lisina en comparación con la cantidad de L-aminoácido deseada. Estos datos de porcentaje corresponden al porcentaje en peso.

Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriaceae poseen, preferiblemente, entre otros, uno o más de los rasgos genéticos o fenotípicos seleccionados del grupo: resistencia a ácido -amino-º-hidroxivalérico, a resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a -aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6dimetilaminopurina, una necesidad de L-metionina, una necesidad, opcionalmente parcial y compensable, de Lisoleucina, una necesidad de ácido meso-diaminopimélico, una auxotrofía con respecto a dipéptidos con contenido en treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina deshidrogenasa defectuosa, opcionalmente una capacidad para hacer uso de sacarosa, potenciación del operón treonina, potenciación de homoserina deshidrogenasa I-aspartato quinasa I, preferiblemente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de homoserina quinasa, potenciación de treonina sintasa, potenciación de aspartato quinasa, opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de aspartato semialdehído deshidrogenasa, potenciación de fosfoenolpiruvato carboxilasa, opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de fosfoenolpiruvato sintasa, potenciación de transhidrogenasa, potenciación del producto génico RhtB, potenciación del producto génico RhtC, potenciación del producto génico YfiK, potenciación de un piruvato carboxilasa, y atenuación de la formación de... [Seguir leyendo]

1. Bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a ácido a -amino-hidroxivalérico, en donde dichas bacterias contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS un (1) codón de terminación del tipo ámbar y (2) el correspondiente supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2.

2. Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 1, en donde producen no más de 40% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.

3. Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 2, en donde producen no más de 10% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.

4. Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 2, en donde producen no más de 5% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.

5. Bacterias productoras de L-treonina según las reivindicaciones 1-4, en donde uno o más de los genes elegidos del grupo indicado más abajo se potencian simultáneamente, en particular se sobre-expresan:

q) el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) , r) el gen lrp que codifica el regulador en el regulón de leucina, s) el gen csrA que codifica el regulador global.

6. Bacterias productoras de L-treonina según las reivindicaciones 1-5, en donde están atenuados otros genes.

7. Un procedimiento para preparar L-treonina o aditivos de piensos con contenido en L-treonina, que contiene las siguientes etapas

a) fermentación de bacterias de la especie Escherichia coli, que son resistentes al ácido -amino-

a hidroxivalérico y que contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID No. 2 un codón de terminación del tipo ámbar y 2) el correspondiente supresor ámbar, supE, b) enriquecimiento de la L-treonina en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento de la L-treonina, en donde opcionalmente constituyentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad, o una proporción de los mismos (> 0 a 100) permanecen en el producto.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que se utiliza la cepa DM1690 de E. coli, depositada como DSM 15189.

9. Cepa DM1690 de Escherichia coli depositada como DSM 15189 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) .

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