Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina.

Bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina,

que son resistentes a ácido -amino-ß-hidroxivalérico, en donde dichas bacterias contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS un (1) codón de terminación del tipo ámbar y (2) el correspondiente supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipoámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2003/002055.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11 45128 ESSEN ALEMANIA.

Inventor/es: SIEBELT, NICOLE, RIEPING, MECHTHILD.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/52 C12N 15/00 […] › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
  • C12P13/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › alfa- o beta-Aminoácidos.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

PDF original: ES-2378985_T3.pdf

 

  • Fb
  • Twitter
  • G+
  • 📞
  • Pinit
Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina.

Fragmento de la descripción:

Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina Campo de la invención La invención se refiere a bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del gen rpoS y el correspondiente supresor para el codón de terminación, el supresor ámbar SupE. Esta invención se refiere también a un procedimiento para preparar L-treonina utilizando estas bacterias.

Técnica anterior L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de manera muy particular, en piensos para animales.

Es conocido que los L-aminoácidos se preparan mediante fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Se han buscado siempre mejoras en los métodos de preparación debido a la gran importancia de este procedimiento. Las mejoras en el procedimiento pueden referirse a las medidas tecnológicas de la fermentación tales como, p. ej., agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutricios tales como, p. ej., la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento para obtener la forma de producto, p. ej., mediante cromatografía de intercambio de iones, o las características de comportamiento intrínseco del propio microorganismo.

Para mejorar las características de comportamiento de estos microorganismos, se utilizan los métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De este modo, se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos tales como p. ej., el análogo de treonina, ácido a-amino-º-hidroxivalérico (AHV) , o son auxotróficas para importantes metabolitos reguladores y producen L-aminoácidos tales como p. ej., L-treonina.

Los métodos de la ingeniería de ADN recombinante también se han utilizado durante un cierto número de años para la mejora de la cepa de cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, al multiplicar genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos y someter a ensayo el efecto sobre la producción.

El gen rpoS, que también se conoce bajo el nombre de gen katF, codifica una proteína que se denomina el factor 038

o factor 0S, la proteína 038 o la subunidad 038 o incluso la proteína RpoS. En la bibliografía se encuentran también los siguientes nombres para el gen rpoS, aunque menos habitualmente: abrD, dpeB, appR, sigS, otsX y snrA. El factor 0S, en calidad de una subunidad de ARN-polimerasa, controla la expresión de una amplia diversidad de diferentes grupos de genes (Loewen et al.; Canadian Journal of Microbiology 44 (8) : 707-717 (1998) ) , en donde los mecanismos de regulación son a menudo poco claros.

Datos sobre la secuencia de nucleótidos del gen rpoS o katF se pueden encontrar en Mulvey y Loewen (Nucleic Acids Research 17 (23) : 9979-9991 (1989) ) y en Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997) ) . Datos correspondientes también se pueden encontrar en el Centro Nacional para la Información de Biotectonología (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo los números de acceso X16400 y AE000358. El inicio de la traducción o el codón de iniciación para el gen rpoS se determinó por Loewen et al. (Journal of Bacteriology 175 (7) : 2150-2153 (1993) ) .

Además, se conoce un cierto número de alelos rpoS en cepas de Escherichia coli, por ejemplo en cepas del tipo W3110 (Ivanova et al.; Nucleic Acids Research 20 (20) : 5479-5480 (1992) y Jishage e Ishihama; Journal of Bacteriology 179 (3) : 959-963 (1997) ) .

En el documento WO 01/05939 se demuestra que, después de una desconexión completa del factor 038 al incorporar una deleción en el gen rpoS de un productor de ácido L-glutámico, se mejora la producción de ácido glutámico.

Nagano et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistr y 64 (9) : 2012-2017 (2000) ) informan sobre una cepa W3110 de Escherichia coli y los mutantes W196 productores de L-lisina, conteniendo ambos un alelo rpoS que contiene un codón de terminación ámbar (TAG) en el punto correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína 0 38. La cepa W196 contiene también una mutación en el gen serU que codifica ARNt de L-serina que se denomina supD.

Descripción de la invención Siempre que se mencionen aminoácidos o L-aminoácidos en lo que sigue, estos pretenden cubrir todos los aminoácidos proteinogénicos, con la excepción de L-lisina. Esto significa, en particular, L-treonina, L-isoleucina, Lhomoserina, L-metionina, ácido L-glutámico, L-valina y L-triptófano, en donde se prefiere L-treonina.

"Aminoácidos proteinogénicos" se entiende que son aquellos aminoácidos que son constituyentes de proteínas. Estos incluyen los aminoácidos L-glicina, L-alanina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, L-metionina, L-prolina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-asparagina, L-glutamina, ácido L-aspártico, ácido Lglutámico, L-arginina, L-lisina, L-histidina y L-selenocisteína.

La invención proporciona bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes al ácido a-amino-º-hidroxivalérico (= AHV) y que 1) contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del gen rpoS, y 2) contienen el correspondiente supresor para el codón de terminación, supresor ámbar supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID NO. 2.

Las bacterias proporcionadas por la presente invención, pueden producir L-treonina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Son representantes de la familia Enterobacteriaceae, elegidos de la especie Escherichia coli.

Las bacterias productoras de L-treonina proporcionadas por la presente invención pueden, entre otros, producir opcionalmente L-lisina como un producto secundario, además del L-aminoácido deseado. Bacterias de acuerdo con la invención producen a lo sumo 0 a 40% o 0 a 20%, preferiblemente a lo sumo 0 a 10%, de manera particularmente preferida a lo sumo 0 a 5% de L-lisina en comparación con la cantidad de L-aminoácido deseada. Estos datos de porcentaje corresponden al porcentaje en peso.

Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriaceae poseen, preferiblemente, entre otros, uno o más de los rasgos genéticos o fenotípicos seleccionados del grupo: resistencia a ácido -amino-º-hidroxivalérico, a resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a -aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6dimetilaminopurina, una necesidad de L-metionina, una necesidad, opcionalmente parcial y compensable, de Lisoleucina, una necesidad de ácido meso-diaminopimélico, una auxotrofía con respecto a dipéptidos con contenido en treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina deshidrogenasa defectuosa, opcionalmente una capacidad para hacer uso de sacarosa, potenciación del operón treonina, potenciación de homoserina deshidrogenasa I-aspartato quinasa I, preferiblemente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de homoserina quinasa, potenciación de treonina sintasa, potenciación de aspartato quinasa, opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de aspartato semialdehído deshidrogenasa, potenciación de fosfoenolpiruvato carboxilasa, opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de fosfoenolpiruvato sintasa, potenciación de transhidrogenasa, potenciación del producto génico RhtB, potenciación del producto génico RhtC, potenciación del producto génico YfiK, potenciación de un piruvato carboxilasa, y atenuación de la formación de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a ácido a -amino-hidroxivalérico, en donde dichas bacterias contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS un (1) codón de terminación del tipo ámbar y (2) el correspondiente supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2.

2. Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 1, en donde producen no más de 40% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.

3. Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 2, en donde producen no más de 10% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.

4. Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 2, en donde producen no más de 5% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.

5. Bacterias productoras de L-treonina según las reivindicaciones 1-4, en donde uno o más de los genes elegidos del grupo indicado más abajo se potencian simultáneamente, en particular se sobre-expresan:

a) el operón thrABC que codifica aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa, b) el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa, c) el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato sintasa, d) el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa, e) los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa, f) el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina, g) el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa, h) el gen rhtC que imparte resistencia a treonina, i) el gen thrE procedente de Cor y nebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación de treonina, j) el gen gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa, k) el gen hns que codifica la proteína HLP-II de unión a ADN, l) el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa, m) el gen fba que codifica fructosa bifosfato aldolasa, n) el gen ptsI en el operón ptsHIcrr que codifica la enzima I en el sistema de fosfotransferasa (PTS) , o) el gen ptsH en el operón ptsHIcrr que codifica la proteína de fosfohistidina, hexosa fosfotransferasa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) , p) el gen crr en el operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico para glucosa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) ,

q) el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) , r) el gen lrp que codifica el regulador en el regulón de leucina, s) el gen csrA que codifica el regulador global.

6. Bacterias productoras de L-treonina según las reivindicaciones 1-5, en donde están atenuados otros genes.

t) el gen fadR que codifica el regulador para el regulón fad, u) el gen iclR que codifica el regulador para el metabolismo intermedio central, v) el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kd, que también se conoce por el nombre groES, w) el gen ahpC en el operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa, x) el gen ahpF en el operón ahpCF que codifica la subunidad grande en la alquil hidroperóxido reductasa, y) el gen cysK que codifica cisteína sintasa A, z) el gen cysB que codifica el regulador para el regulón cys, aa) el gen cysJ en el operón cysJIH que codifica la flavoproteína en NADPH sulfito reductasa, bb) el gen cysH en el operón cysJIH que codifica adenilsulfato reductasa, y cc) el gen cysI en el operón cysJIH que codifica la hemoproteína en NADPH sulfito reductasa,

7. Un procedimiento para preparar L-treonina o aditivos de piensos con contenido en L-treonina, que contiene las siguientes etapas

a) fermentación de bacterias de la especie Escherichia coli, que son resistentes al ácido -amino-

a hidroxivalérico y que contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID No. 2 un codón de terminación del tipo ámbar y 2) el correspondiente supresor ámbar, supE, b) enriquecimiento de la L-treonina en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento de la L-treonina, en donde opcionalmente constituyentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad, o una proporción de los mismos (> 0 a 100) permanecen en el producto.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que se utiliza la cepa DM1690 de E. coli, depositada como DSM 15189.

9. Cepa DM1690 de Escherichia coli depositada como DSM 15189 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) .

pbs pbs


 

Patentes similares o relacionadas:

Producto y proceso para transformación de microorganismos de Thraustochytriales, del 7 de Noviembre de 2018, de DSM IP ASSETS B.V.: Un método para producción de una proteína, que comprende: cultivar un microorganismo recombinante del Orden Thraustochytriales en un medio, en el que […]

Antígeno vacuna capaz de inducir anticuerpos de reacción cruzada y neutralizante contra el virus del papiloma humano del tipo de alto riesgo, del 2 de Noviembre de 2018, de Japan Health Sciences Foundation: Una cápside que es un agregado formado por el ensamblaje de proteína quimérica compuesta por la proteína L1 del virus del papiloma humano (VPH) genotipo […]

Productos génicos de expresión diferencial en tumores y su uso, del 31 de Octubre de 2018, de Ganymed Pharmaceuticals GmbH: Composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad de cáncer que se distingue por la expresión de un antígeno asociado […]

Región constante de anticuerpo modificado, del 29 de Octubre de 2018, de CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA: Una región constante de anticuerpo humano que comprende deleciones de ambas Gly en la posición 329 (posición 446 en el sistema de numeración EU) y Lys en la posición 330 (posición […]

Ácido nucleico que codifica un polipéptido implicado en la entrada celular del virus del PRRS, del 23 de Octubre de 2018, de UNIVERSITEIT GENT: Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos […]

Método de bioensayo para la detección de sustancia fisiológicamente activa, del 23 de Octubre de 2018, de OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD.: Un kit para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica, que comprende una célula que expresa un GPCR acoplado […]

Aptámero para NGF y sus aplicaciones, del 23 de Octubre de 2018, de RIBOMIC INC: Un aptámero que se une a NGF y es capaz de formar una estructura secundaria potencial representada por la fórmula (I):**Fórmula** en donde N es […]

Vacuna de toxinas bacterianas, del 19 de Octubre de 2018, de IDEMITSU KOSAN CO., LTD.: Una proteína híbrida que comprende (a) dos proteínas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína toxina Shiga (Stx), proteína […]