Anticuerpo capaz de unirse específicamente al receptor de transferrina y de bloquear la unión de la transferrina a dicho receptor,

caracterizado porque se selecciona entre:

- el anticuerpo A24 producido por el hibridoma CNCM1-2665; - un anticuerpo recombinante que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligera y pesada de A24.

Anticuerpo anti-TfR

La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de transferrina (TfR) y a su utilización para la inmunoterapia de enfermedades hiperproliferativas, tal como cáncer.

El receptor de transferrina (CD71) es una glicoproteína de transmembrana homodimérica unida por enlace disulfuro que comprende dos monómeros de 760 aminoácidos de aproximadamente 90kDa cada uno. TfR juega un papel crucial en la regulación de la absorción de hierro y en el crecimiento celular (Gill y otros, N Engl J Med., 332, 17441748, 1995 - Hermine y otros, N Engl J Med, 332, 1749-1751, 1995) . Cuando la transferrina diférrica se une a su receptor de la superficie celular, va hacia el interior a través de agujeros recubiertos de clatrina hacia vesículas ácidas en las que es disociado el complejo hierro-transferrina. Después de la liberación, el receptor y la apotransferrina son reciclados hacia la superficie celular.

El TfR se expresa constitutivamente en células de tejidos que se renuevan constantemente, tales como precursores de células sanguíneas en la médula ósea, hepatocitos en el hígado, los queratinocitos en la epidermis y enterocitos en las criptas del epitelio intestinal. Varios estudios han demostrado que TfR se expresa con mayor abundancia en los tejidos malignos que en sus homólogos sanos (Gatter y otros, J Clin Pathol, 36, 539-545, 1983 - FAULK y otros, Lancet, 2, 390-392, 1980 - Shindelman y otros, Int J Cancer, 27, 329-334, 1981) . Varios autores han reportado enfoques terapéuticos basados en esta idea utilizando anticuerpos anti-TfR o la propia transferrina conjugados con medicamentos que destruyen las células malignas.

También se ha propuesto utilizar anticuerpos anti-TfR para bloquear la interacción entre transferrina y TfR y, por consiguiente, la absorción de hierro, lo que conlleva a la supresión del hierro y la regulación negativa del crecimiento celular. Sin embargo, aunque muchas publicaciones describen la preparación de anticuerpos anti-TfR, hay muy pocos informes de anticuerpos monoclonales (mAb) anti-TfR que tienen una actividad antiproliferativa.

Trowbridge y Lopez (Proc. Natl Acad Sci USA, 79, 1175-1179, 1982) reportaron las propiedades de un anticuerpo monoclonal, designado 42/6 y tipificado como IgA (k) , que bloquea la unión de transferrina a su receptor y es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de una línea de células T humanas leucémicas, mediante el bloqueo de las células en fase S del ciclo celular. El anticuerpo 42/6 y el hibridoma que lo produce (ATCC HB-8094) se dan a conocer en la patente de EE.UU. 4.434.156.

Taetle y otros (Cancer Res., 46, 1759-1763, 1986) han comparado el anticuerpo 42/6 con otro anticuerpo monoclonal anti-receptor de la transferrina (B3/25) , que pertenece a la clase IgG, no bloquea la unión de transferrina a su receptor y no inhibe el crecimiento de los linfocitos. Observaron que la transferrina no inhibió la unión de 42/6, lo que sugiere que la inhibición de la unión de transferrina por el anticuerpo 42/6 inhibido es el resultado de un mecanismo no competitivo, posiblemente estérico.

El anticuerpo 42/6 ha sido probado en un ensayo de Fase Ia y se observó que, de manera general, fue bien tolerado, y que las concentraciones de anticuerpo que fueron capaces de inhibir el crecimiento maligno de células sanguíneas se obtuvieron sin toxicidad. (Brooks y otros, Clin Cancer Res., 1, 1259-1265, 1995) .

Inicialmente se sugirió que las propiedades antiproliferativas del anticuerpo 42/6 eran el resultado de su capacidad para bloquear la unión a transferrina, privando así de hierro a las células, y que otros anticuerpos que tienen la misma capacidad podrían tener las mismas propiedades antiproliferativas. Sin embargo, otros estudios han demostrado que la situación es más complicada.

White y otros (Cancer Res., 50, 6295-301, 1990) y la patente de EE.UU. 5.667.781 dan a conocer los efectos de 42/6, B3/25 y otros 32 anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio externo de TfR (todos de la clase IgG) , sobre la unión de transferrina a su receptor y sobre el crecimiento de células T leucémicas en cultivo de tejidos. No se encontró ningún otro anticuerpo diferente de 42/6 que fuera capaz de inhibir la unión de la transferrina. La mayoría de los anticuerpos IgG no tuvo efecto poco inhibidor o muy poco efecto sobre el crecimiento de las células T leucémicas. Sólo uno de ellos, designado D65.30 y que pertenece al isotipo IgG1, mostró propiedades inhibidoras del crecimiento similares a las de 42/6, aunque no inhibió la unión de la transferrina a TfR. También fueron ensayadas combinaciones de dos o más de estos anticuerpos monoclonales anti-TfR. Algunas de ellas no difieren en sus efectos inhibidores del crecimiento de los anticuerpos individuales, otras fueron antagónicas y algunas de ellas mostraron un efecto sinérgico inhibidor del crecimiento. Algunas de estas combinaciones mostraron una acción citotóxica, mientras que los anticuerpos individuales tuvieron una acción citostática, o eran inactivos. Estas combinaciones de anticuerpos monoclonales con elevadas propiedades antiproliferativas no bloquearon la unión de transferrina a TfR. La incubación prolongada (48 h) de las células con las combinaciones antiproliferativas B3/25 y 42/6, o D65.30 y A27.15, o con los anticuerpos individuales B3/25, 42/6, o D65.30 indujo una regulación por descenso de la expresión de TfR superficial resultando en una reducción de la unión a Tf a 4º C y 37º C. Sin embargo, sólo 42/6 de forma individual y las combinaciones B3/25 y 42/6 o D65.30 y A27.15 fueron capaces de reducir la internalización de TfR.

Lesley y otros (Mol Cell. Biol. 5, 1814-21, 1985) han estudiado los efectos de anticuerpos monoclonales antireceptores de transferrina murinos pertenecientes a cualquiera de las clases IgG o IgM, sobre la unión de la transferrina y sobre el crecimiento celular in vitro de linfoma murino. Se observó que la IgM inhibió el crecimiento celular, pero que la IgG no lo hizo, aunque fueron capaces de inducir una regulación por descenso y una degradación de la TfR. Sin embargo, la IgG reticulada por un anticuerpo anti-inmunoglobulina fue capaz de inhibir el crecimiento celular. En un trabajo posterior, el mismo equipo (Lesley y otros, Exp. Cell Res., 182, 215-33, 1989) estudiaron los efectos de anticuerpos monoclonales IgG e IgM anti-TfR y de sus fragmentos mono y divalentes sobre el crecimiento de células de linfoma de ratón y la expresión de TfR. Informaron que estos efectos dependen del grado de reticulación de los receptores de transferrina por el anticuerpo, que es una consecuencia de la valencia del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo monovalentes no tuvieron efectos significativos; los fragmentos de anticuerpo divalentes indujeron una regulación por descenso de la expresión del receptor de superficie celular sin afectar su internalización y reciclado y sin afectar el crecimiento celular; los IgM multivalentes indujeron la acumulación del receptor del complejo de anticuerpo sobre la superficie celular, bloqueando su internalización y resultando en una fuerte inhibición del crecimiento celular.

Se desprende de la técnica anterior mencionada anteriormente que las propiedades antiproliferativas de los anticuerpos anti-TfR varían mucho de un anticuerpo a otro y que no se puede predecir en base a su capacidad para bloquear o no la unión de transferrina a su receptor.

En una publicación anterior (Moura y otros, J. Exp. Med., 194, 417-425, 2001) , los inventores informaron que un anticuerpo monoclonal IgG (IgG2kappa) , designado A24, producido por uno de los hibridomas obtenidos a partir de un ratón hiperinmunizado con proteínas de unión a IgA, estaba en realidad dirigido contra el TfR humano.

Los presentes inventores han encontrado ahora que el anticuerpo A24 es capaz de bloquear la proliferación de células T y que parece ser más eficaz que el mAb 42/6 anteriormente descrito en la inhibición de la proliferación de células T. Se han estudiado las propiedades de unión de A24 a TfR y se encontró que al igual que 42/6, inhibe la unión de transferrina a TfR; sin embargo, en contraste con el 42/6, que inhibe la unión de transferrina a TfR mediante un mecanismo no competitivo, A24 evita la unión de Tf a TfR de una forma competitiva. El A24 también reduce la expresión de TfR y afecta el reciclado de TfR.

Los presentes inventores también han ensayado los efectos de A24 en células T malignas de formas agudas y crónicas de ATL (células T de leucemia/linfoma de adulto) , que expresan... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo capaz de unirse específicamente al receptor de transferrina y de bloquear la unión de la transferrina a dicho receptor, caracterizado porque se selecciona entre: 5

- el anticuerpo A24 producido por el hibridoma CNCM1-2665;

- un anticuerpo recombinante que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligera y pesada de

A24. 10

2. Anticuerpo, según la reivindicación 1, seleccionado entre un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado.

3. Fragmento de anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, seleccionado entre los fragmentos Fv,

Fab, Fab'2 o scFv. 15

4. Proteína recombinante que comprende un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o un Fv, Fab, Fab'2 o scFv del mismo, fusionado a un polipéptido heterólogo.

5. Polinucleótido aislado seleccionado entre: 20

- un polinucleótido que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2;

- un polinucleótido que codifica un fragmento, según la reivindicación 3; 25

- un polinucleótido que codifica una proteína recombinante, según la reivindicación 4.

6. Proteína seleccionada entre.

30. un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2;

- un fragmento Fv, Fab, Fab'2 o scFv, según la reivindicación 3,

- una proteína recombinante, según la reivindicación 4;

para su uso como medicamento.

7. Uso de un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para la fabricación de un medicamento para tratar un tumor. 40

8. Uso, según la reivindicación 7, en el que dicho tumor es un linfoma.

9. Uso de un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento

para tratar la nefropatía por IgA. 45