Un anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana, que comprende una región variable de cadena pesada queconsiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID.

SEC. nº 1 y una región variable de cadena ligera queconsiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID. SEC. nº 3.

Anticuerpo anti-osteopontina humana humanizado.

Campo técnico

El presente invento se refiere a un anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana que tiene una actividad y una estabilidad excelentes.

Técnica fundamental

La osteopontina (a la que en lo sucesivo se hace referencia como "OPN") es una glicoproteína ácida ligante de calcio que se encuentra abundantemente en el hueso, y, en el caso de los seres humanos, se sabe que se pueden encontrar al menos tres isoformas debidas a diferencias en el corte y empalme de mRNA: osteopontina a (a la que en lo sucesivo se hace referencia como "OPN-a") , osteopontina b (a la que en lo sucesivo se hace referencia como "OPN-b") y osteopontina c (a la que en lo sucesivo se hace referencia como "OPN-c") (documento 1 no de patente) . En particular, el precursor de la OPN-a tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID. SEC. nº 23 en la lista de secuencias proporcionada más adelante, y se considera que, tras la secreción, experimenta una escisión de péptido señal para formar la forma OPN-a madura de I17-N314. La forma madura de OPN es escindida in vivo por trombina en el lado C-terminal del 168º resto de arginina (en el caso de la OPN-a) , lo que da lugar a un fragmento Nterminal y un fragmento C-terminal.

La OPN anteriormente descrita es responsable de una gran variedad de funciones fisiológica y patológicamente importantes y ejerce funciones tales como, por ejemplo, adhesión celular, migración celular, tumorigénesis, respuestas inmunes, inhibición de citólisis mediada por complemento, y similares. Estas diversas funciones son mediadas por una gran variedad de receptores de la superficie celular. La OPN contiene la secuencia RGD (por ejemplo, para la OPN-a, los restos 159º a 161º) ; las integrinas que reconocen esta secuencia RGD, tales como aVº3, aVº1 y aVº5, son receptores importantes de la OPN, de entre las cuales, las integrinas aVº3, aVº1 y aVº5 median en la adhesión celular en células del músculo liso vascular; además, la aVº3 está asociada con la migración de macrófagos, linfocitos, células endoteliales, células de músculo liso y similares.

Además, una investigación que se ha llevado a cabo hasta la fecha ha demostrado también que la OPN se une a las integrinas a9º1, a4º1 y a4º7 a través de la secuencia SVVYGLR (ID. SEC. nº 10) , y se ha hallado una diferencia en el modo de unión ya que la a4º1 se une tanto a la OPN no escindida por trombina (OPN de tipo no escindido) como a un fragmento N-terminal escindido por trombina (OPN de tipo escindido) , mientras que la a9º1 sólo se une a la OPN de tipo escindido por trombina (documentos 2 a 4 no de patente) . Estas subunidades de integrina a9 y a4 y º1 y º7 son muy similares entre sí en términos de la secuencia de aminoácidos. Las integrinas a4º1 y a4º7 se encuentran principalmente en linfocitos y monocitos pero se expresan con niveles muy bajos en neutrófilos. Por otro lado, la a9º1 se expresa mucho de forma selectiva en neutrófilos y es responsable de las funciones esenciales para la migración de neutrófilos a través de VCAM-1, tenascina C y similares. La a9º1 se expresa mucho en miocitos, células epiteliales, hepatocitos y similares. Por lo tanto, se considera que los dominios citoplásmicos de la subunidades a4 y a9 de integrina están implicados en diversas reacciones inflamatorias al promover cooperativamente la migración y agregación de leucocitos a sitios de inflamación a través de sus respectivas vías intracelulares ligeramente diferentes de transducción de señales, para potenciar las actividades de infiltración de los mismos.

Como se describió anteriormente, puesto que una gran variedad de integrinas promueven la migración de leucocitos y están implicadas en reacciones inflamatorias, se piensa que los fármacos que inhiben estas actividades de integrina tienen el potencial para actuar como agentes antiinflamatorios. Por ejemplo, la integrina aVº3 se expresa en osteoclastos, células endoteliales vasculares, células de músculo liso y similares; puesto que se espera que la inhibición de la unión entre la integrina aVº3 y diversos ligandos de unión de la misma ejerza una acción supresora de la destrucción articular en, por ejemplo, las articulaciones, está realmente en curso el desarrollo de un anticuerpo anti- aVº3.

Sin embargo, puesto que los receptores que pertenecen a la familia de las integrinas se expresan universalmente en una gran variedad de tejidos y son responsables de las funciones esenciales para el mantenimiento de actividades biológicas, el uso de un anticuerpo contra una integrina en el tratamiento de la artritis reumatoide o la osteoartritis puede causar una inhibición similar en otros sitios, y el inicio de reacciones negativas resulta preocupante.

Desde este punto de vista, hasta la fecha se han realizado intentos para aclarar la etiología de la artritis reumatoide, la osteoartritis y similares y para proporcionar un mejor método terapéutico.

Por ejemplo, en el Documento WO02/081522 (documento 1 de patente) se halló que, en pacientes con reumatismo y pacientes con osteoartritis, la concentración de OPN en fluido de cavidad articular tenía valores elevados y, en pacientes con reumatismo, aumentaba la relación entre el fragmento N-terminal de tipo escindido por trombina y la OPN total, y se confirmó que la OPN estaba profundamente asociada con el inicio de estas enfermedades. En el documento 1 de patente, se generaron anticuerpos que reconocían aisladamente el fragmento N-terminal y el fragmento C-terminal que resultaban de la escisión de OPN con trombina, respectivamente, y en un estudio en que se usaban estos se mostró que, en pacientes con artritis reumatoide, en particular, el fragmento N-terminal escindido por trombina presentaba elevadas concentraciones en la cavidad articular. En este fragmento N-terminal coexisten tanto la secuencia RGD como la secuencia SVVYGLR (ID. SEC. nº 10) , ambas reconocidas por integrinas de tipo humano; se ha confirmado que un anticuerpo que bloquea simultáneamente estas dos secuencias inhibe mucho la unión de OPN e integrina y es eficaz en el tratamiento de la artritis reumatoide, la osteoartritis y similares.

Específicamente, en el documento 1 de patente, se generó un anticuerpo que inhibe la unión entre la secuencia RGD de OPN humana y la integrina y la unión entre la secuencia SVVYGLR de OPN humana (ID. SEC. nº 10) y la integrina, y su efecto fue confirmado mediante experimentos de adhesión celular, migración celular y similares. Además, se consiguió un anticuerpo contra un péptido sintético que correspondía a la secuencia interna de la OPN de ratón y, usando un modelo patológico de artritis en ratón, se confirmó su efecto como fármaco terapéutico.

Por lo tanto, puesto que la OPN de ratón tiene la secuencia RGD y la secuencia SLAYGLR (ID. SEC. nº 12) , ambas reconocidas por integrina de ratón, en posiciones de la secuencia de aminoácidos homólogas a las de la OPN humana, se consiguió el anticuerpo M5 como un anticuerpo que bloquea simultáneamente estas secuencias. Se confirmó que la unión de este anticuerpo M5 a la OPN de ratón y al producto de la misma digerido con trombina era inhibida por el péptido GRGDSP, que comprende la secuencia RGD, y que este anticuerpo M5 inhibía la migración de monocitos activados por TNF-a, procedentes del bazo del ratón. Cuando se examinó este anticuerpo M5 utilizando un sistema de cultivo de órganos de cráneos de ratón, se observó una acción supresora de la destrucción ósea. Además cuando se administró el anticuerpo anteriormente descrito a un modelo de ratón con artritis por colágeno, se confirmó un evidente efecto terapéutico (documento 1 de patente y documento 5 no de patente) .

Estos resultados sugieren acusadamente que un anticuerpo que bloquea simultáneamente la unión entre la secuencia RGD y la integrina de tipo humano y entre la secuencia SVVYGLR (ID. SEC. nº 10) y la integrina de tipo humano inhibe la unión entre la OPN y la integrina y es eficaz en el tratamiento de la artritis reumatoide y similares, y muestran además que se espera que el anticuerpo sea eficaz no sólo en el tratamiento de formas de reumatismo tales como la artritis reumatoide juvenil y el reumatismo crónico sino también en el tratamiento de la artritis psoriásica y la psoriasis. El rechazo crónico de injertos después de un trasplante de órgano se caracteriza por lesiones obstructivas en vasos sanguíneos y bronquios; a partir de investigaciones histológicas de los mismos, se considera que, puesto que la activación de células T y macrófagos causa la producción... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana, que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID. SEC. nº 1 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID. SEC. nº 3.

2. El anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana de la Reivindicación 1, en que la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igy1 humana.

3. El anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana de la Reivindicación 1, en que la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK humana.

4. El anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana de la Reivindicación 1, en que la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igy1 humana y la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK humana.

5. Un anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana, que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID. SEC. nº 25 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la ID. SEC. nº 27.

6. Un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana de la Reivindicación 1.

7. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido descrito en la Reivindicación 6.

8. Una célula huésped que lleva incorporado el vector de expresión de la Reivindicación 7.

9. Un método para producir un anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana, que comprende una operación para cultivar la célula huésped de la Reivindicación 8 para permitir que la célula exprese el anticuerpo humanizado anti-osteopontina humana.