ANITCUERPOS MONOCLONALES DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEÍNA CLFA Y MODO DE EMPLEO EN EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE INFECCIONES.

Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína CLFA y modo de empleo en el tratamiento y prevención de infecciones Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere de manera general a anticuerpos que hayan sido generados contra el factor de aglutinación A (o ClfA), una proteína localizada en la superficie de Staphylococcus aureus y otras bacterias Staphylococcus, y en particular a un anticuerpo monoclonal contra la proteína ClfA y sus fragmentos o proteínas activas procedentes de su dominio de unión a fibrinógeno tal como Clf33, y su uso en la inhibición de la unión de la proteína ClfA a fibrinógeno o fibrina y al tratamiento o la prevención de infecciones por Staphylococcus aureus. Antecedentes de la invención [0002] La colonización con éxito del hospedador es un proceso necesario para que la mayoría de microorganismos puedan provocar infecciones en animales y seres humanos. La adhesión microbiana es la primera etapa crucial en una serie de acontecimientos que eventualmente dan lugar a la enfermedad. Los microorganismos patógenos colonizan el hospedador atacando los tejidos del hospedador o biomateriales implantados acondicionados para el suero, tales como catéteres, articulaciones artificiales, e injertos vasculares, mediante adhesinas específicas presentes en la superficie de las bacterias. Las MSCRAMs (Moléculas adhesivas de la matriz que reconocen componentes de la superficie microbiana) son una familia de adhesinas de la superficie celular que reconocen y que se unen específicamente a diferentes componentes de la matriz extracelular del hospedador. Una vez que la bacteria se ha adherido y ha colonizado con éxito los tejidos del hospedador, su fisiología se ve drásticamente alterada y se segregan componentes dañinos tales como toxinas y enzimas proteolíticas. Además, las bacterias adherentes a menudo producen una película biológica y rápidamente se vuelven más resistentes al efecto letal de la mayoría de los antibióticos. [0003] S. aureus provoca un abanico de infecciones que van desde lesiones cutáneas tales como infecciones 30 de heridas, impétigo, y forúnculos a dolencias que suponen un peligro para la vida, incluyendo neumonía, artritis séptica, sepsis, endocarditis, e infecciones relacionadas con los materiales biológicos. Se sabe que S. aureus expresa un repertorio de MSCRAMMs diferentes que pueden actuar individual o conjuntamente para facilitar la adhesión microbiana a componentes tisulares específicos del hospedador. Las MSCRAMMs proporcionan una diana excelente para el ataque inmunológico por parte de los anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. La 35 presencia de anticuerpos apropiados de alta afinidad dirigidos contra MSCRAMMs puede proporcionar un ataque de doble filo, primero los anticuerpos pueden evitar la adherencia microbiana y segundo los niveles incrementados de anticuerpos contra MSCRAMMs facilitan que el organismo se elimine rápidamente del cuerpo mediante muerte opsonofagocítica. 40 [0004] No obstante, aún queda el problema de identificar y utilizar la información concerniente a las MSCRAMMs de S. aureus, tal como la proteína ClfA, para generar anticuerpos monoclonales eficaces debido a la variabilidad en las propiedades de unión de las diferentes MSCRAMMs y su papel en la capacidad de infección y propagación de las infecciones bacterianas. En particular, ha sido un problema desarrollar anticuerpos monoclonales que se puedan unir a la ClfA y que se pueden usar para inhibir o dificultar la unión de la ClfA de estafilococo al 45 fibrinógeno o la fibrina y, así, ser útil en procedimientos de prevención o tratamiento de infecciones por estafilococo. Por tanto, sigue siendo un objetivo muy deseable en el campo de las enfermedades infecciosas el desarrollo de anticuerpos monoclonales y otras composiciones que tengan éxito en el tratamiento y prevención de una amplia variedad de infecciones por estafilococo, particularmente inhibiendo o dificultando la capacidad de unión de la bacteria al fibrinógeno o la fibrina. [0005] El documento WO 00/64925 describe el uso de anticuerpos basados en las regiones CIf40 y CIf41 de la CIfA en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias de estafilococo.   [0006] El documento US 6.008.341 describe el aislamiento de la proteína de unión a fibrinógeno de S. aureus y su uso en la generación de anticuerpos. [0007] O'Connell y col. (J. Biol. Chem. Vol. 273, No. 12, pp 6821-6898; 1998) investiga la proteína CIfA de S. aureus y demuestra que la región A de CIfA puede unir Ca 2+ y que la interacción entre la región A de CIfA y el fibrinógeno está inhibida por concentraciones milimolares de Ca 2+ . [0008] Hartford y col. (Molecular Microbiol. (1997) 25(6), 1065-1076 también estudia la proteína CIfA de S. aureus y, en particular, si la región R tiene un papel en la presentación en superficie del dominio de unión al fibrinógeno de la región A. 2 [0009] Hartford y col. (J. Biol. Chem. Vol. 276, No. 4 pp 2466-2473; 2001) también describe el estudio de la proteína CIfA de S. aureus, y en particular su unión al fibrinógeno. Los autores describen anticuerpos policlonales generados contra un truncado recombinante de CIfA, compuesto de los restos 5000-559 de la región A. Han encontrado que estos anticuerpos son capaces de bloquear la interacción entre S. aureus y el fibrinógeno. Resumen de la invención [0010] Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal que se 10 pueda unir al subdominio Clf33 de la proteína ClfA de S. aureus y, así, ser útil en procedimientos para el tratamiento o la prevención de infecciones por estafilococo. El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal 12-9 que tiene (i) una secuencia ligera variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 y sus degenerados; y (ii) una cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 y sus degenerados. [0011] También es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal que sea capaz 20 de unirse a ClfA, y que haya sido generado a partir de los subdominios de unión de la proteína ClfA de S. aureus, Clf33, o sus fragmentos activos, para su utilización en procedimientos de tratamiento o protección frente a infecciones por estafilococo. [0012] También es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal contra las 25 proteínas Clf33 que puede ser útil para evitar la adherencia de bacterias estafilococo, inhibiendo o dificultando la unión de la proteína ClfA a fibrinógeno o fibrina.   [0013] Es un objeto adicional de la invención proporcionar secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen para la secuencia ligera variable y las secuencias pesadas variables del anticuerpo monoclonal de la presente invención. [0014] Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal 12-9 contra el subdominio Clf33 de ClfA que proteja frente a una infección por S. aureus, y que pueda conseguir reactividad cruzada frente a otros tipos de infecciones por estafilococo. [0015] Éstos y otros objetos se proporcionan en virtud de la presente invención que comprende el aislamiento y uso del anticuerpo monoclonal 12-9 contra los subdominios de unión de la proteína ClfA, Clf33, para la prevención y tratamiento de infecciones por estafilococo. La presente solicitud describe de esta forma el descubrimiento, producción, caracterización, y evaluación in vivo de un anticuerpo monoclonal 12-9 dirigido contra Clf33 de ClfA, una proteína localizada en la superficie y expresada virtualmente por todas las cepas de S. aureus. Los datos presentados en este documento demuestran claramente que el anticuerpo monoclonal 12-9 dirigido contra los subdominios activos de ClfA, tales como Clf33, se pueden usar para tratar o proteger frente a infecciones por S. aureus. 45 [0016] El descubrimiento y aislamiento de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ClfA según la presente invención se puede usar para dificultar o inhibir la unión de la proteína ClfA al fibrinógeno o la fibrina y, así, ser útil en procedimientos para el tratamiento o la prevención de infecciones por estafilococo. También se describen composiciones y vacunas adecuadas basadas en los subdominios aislados de la proteína ClfA y los anticuerpos generados contra ellos, así como procedimientos para su uso. [0017] Estas formas de realización y otras modificaciones y formas alternativas dentro del alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia después de la lectura de la presente memoria descriptiva y/o las referencias citadas en el presente documento. 3 Breve descripción... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que se une al subdominio de unión CIf33 de la proteína CIfA de S. aureus, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal 12-9 que tiene (i) una secuencia ligera variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 y sus degenerados; y (ii) una cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 y sus degenerados 2. El anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo trata o previene una infección por S. aureus en un ser humano o un animal. 15 3. El anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo inhibe la unión de bacterias de estafilococo a fibrinógeno o fibrina. 4. El anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es adecuado para la administración por vía parenteral, oral, intranasal, subcutánea, en aerosol o intravenosa a un ser humano o un animal. 5. El anticuerpo según la reivindicación 1 donde el anticuerpo monoclonal es de un tipo seleccionado del grupo constituido por anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos, humanizados y humanos. 6. El anticuerpo según la reivindicación 1 donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla. 7. El anticuerpo según la reivindicación 1 que se genera contra una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. 30 8. El anticuerpo según la reivindicación 7, donde la proteína presenta una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos según la SEQ ID NO: 3, o sus degenerados.   9. El anticuerpo según la reivindicación 1 que tiene una cadena ligera variable seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 18. 10. El anticuerpo según la reivindicación 1 que tiene una cadena pesada variable seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 20. 11. Antisuero aislado que contiene un anticuerpo según la reivindicación 1. 12. Un kit diagnóstico que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 y medios para detectar la unión de ese anticuerpo. 13. El kit diagnóstico según la reivindicación 12 donde dicho medio para la detección de la unión comprende un marcador detectable que está unido a dicho anticuerpo. 14. Un procedimiento de diagnóstico de una infección por S. aureus que comprende la adición de un anticuerpo según la reivindicación 1 a una muestra sospechosa de estar infectada con S. aureus, y la determinación de si se han unido anticuerpos a la muestra. 15. Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una infección por S. aureus que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo de la reivindicación 1 o un vehículo, transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable. 55 16. Un anticuerpo según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por S. aureus que comprende la administración a un paciente humano o animal de una cantidad eficaz de dicho anticuerpo. 17. El anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un antibiótico fisiológicamente 47   aceptable. 18. El anticuerpo según la reivindicación 1 que presenta reactividad cruzada con múltiples cepas de S. aureus. 19. El anticuerpo según la reivindicación 1 que reconoce el dominio A de la proteína ClfA de S. aureus. 20. El anticuerpo según la reivindicación 1 que tiene una cadena ligera variable que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 y una cadena pesada variable que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12. 48