Animal transgénico como modelo de enfermedades fibróticas.

Utilización de un roedor transgénico que comprende un vector transgénico,

comprendiendo el vector transgénico: (i) el locus genómico fra-2, (ii) el promotor H2Kb, e (iii) una secuencia de repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma murino FBJ con una expresión ectópica generalizada o específica de tipo celular de fra-2 que se manifiesta en un fenotipo de enfermedad fibrótica, como modelo de enfermedades fibróticas.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/060183.

Solicitante: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BINGER STRASSE 173 55216 INGELHEIM AM RHEIN ALEMANIA.

Inventor/es: WAGNER, ERWIN, EFERL,ROBERT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01K67/027 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA; OBTENCION DE ANIMALES, NO PREVISTA EN OTRO LUGAR; NUEVAS RAZAS DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • C12N5/07 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células o tejidos animales.

PDF original: ES-2391467_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Animal transgénico como modelo de enfermedades fibróticas

La invención se refiere a modelos animales, en particular a modelos de ratón, para enfermedades fibróticas como la fibrosis pulmonar y los trastornos fibróticos de la piel.

La fibrosis pulmonar es un trastorno devastador que afecta a cinco millones de personas en todo el mundo. Sin embargo, el número real podría ser significativamente superior como consecuencia del diagnóstico erróneo. Típicamente, los pacientes desarrollan la fibrosis pulmonar entrados los cuarenta o cincuenta años, con síntomas tales como la falta de aliento, la tos crónica, la fatiga, la pérdida de apetito y la rápida pérdida de peso. El tiempo de supervivencia medio tras el diagnóstico es inferior a 5 años (Giri, 2003) . La fibrosis pulmonar no se considera una entidad separada sino que habitualmente se desarrolla en el contexto de exposiciones ambientales o acompañando a un síndrome. Las causas comunes son la exposición al amianto, polvos metálicos o sustancias orgánicas, la sarcoidosis (una enfermedad caracterizada por la formación de granulomas) , la exposición a fármacos y la radiación. Con frecuencia, la fibrosis pulmonar se asocia a enfermedades del tejido conectivo o del colágeno, tales como la artritis reumatoide y el escleroderma (Giri, 2003) .

Patológicamente, la enfermedad se caracteriza por inflamación crónica y la producción de colágeno dentro de focos fibroblásticos en el pulmón. Los miofibroblastos, una característica distintiva de los focos fibroblásticos, se cree que

aparecen debido a la activación local de fibroblastos parenquimales por parte del factor β de crecimiento transformante (TGF-β) e históricamente se han considerado la célula productora de colágeno en las lesiones fibróticas (Selman y Pardo, 2003) ; además, el CTGF (factor de crecimiento del tejido conectivo) se considera un factor muy importante y resulta necesario para la diferenciación y expresión del gen del colágeno. Sin embargo, resultados recientes han cuestionado este concepto fundamental y sugieren un origen hematopoyético de los fibroblastos patológicos (Hashimoto et al., 2004) . La enfermedad típicamente cursa con cicatrizaciones en el pulmón y los alveolos que acaban revestidas de tejido fibrótico. Al formarse una cicatriz, el tejido se engrosa, provocando una pérdida irreversible de eficiencia de la capacidad del tejido de transferir oxígeno al flujo sanguíneo (Gross y Hunninghake, 2001) .

Se han implicado varios factores de crecimiento en la patogénesis de la fibrosis pulmonar. Estos factores han sido identificados en virtud de su capacidad de estimular la división de los fibroblastos y la producción de matriz extracelular (ECM) , así como su presencia en los pulmones y líquidos pulmonares de pacientes o animales con enfermedad pulmonar fibrótica. Entre estos factores de crecimiento se incluyen la TGF-β, el factor de crecimiento similar a insulina (IGF) -I, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , los miembros de la familia del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y el factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF) (Krein y Winston, 2002) .

En la actualidad no existe ningún tratamiento efectivo o una cura para la fibrosis pulmonar. Los agentes farmacológicos diseñados para tratar la cicatrización pulmonar todavía se encuentran en fase experimental. Aunque las teorías tradicionales han propuesto que podría ser un trastorno autoinmunológico, los tratamientos destinados a suprimir la inflamación sólo han tenido escaso éxito en la reducción de la progresión fibrótica (Giri, 2003) . Debido a que la fibrosis pulmonar es una enfermedad muy compleja, la predicción de la longevidad de los pacientes tras el diagnóstico varía mucho.

Todavía sigue siendo objeto de debate si la fibrosis pulmonar está causada principalmente por la inflamación crónica (Gross y Hunninghake, 2001) . Originalmente, los datos experimentales sugerían que las enfermedades pulmonares fibróticas se originaban como trastornos inflamatorios. Por ejemplo, la fibrosis pulmonar se desarrolla en el ratón con la expresión ectópica del mediador inflamatorio factor α de necrosis tumoral (TNF-α) en el pulmón (Miyazaki et al., 1995) . Además, en un modelo de bleomicina de la fibrosis pulmonar en el ratón, la fibrosis está precedida por inflamación profunda, incluyendo la producción de niveles elevados de TNF-α (Piguet et al., 1989) . Resulta importante que los ratones deficientes en TNF-α o en receptor de TNF-α son resistentes a la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (Ortiz et al., 1998; Piguet et al., 1997) . Estos resultados condujeron a la premisa de que la fibrosis podría evitarse mediante interrupción de la cascada inflamatoria antes de que se produjesen daños irreversibles en los tejidos. De esta manera, esta teoría explica el entusiasmo inicial de la terapia de corticoesteroides y citotóxica de la fibrosis pulmonar. Sin embargo, ahora resulta evidente que la actual terapia antiinflamatoria proporciona poco beneficio (Giri, 2003) . Por lo tanto, algunos estudios han intentado demostrar que el trastorno pulmonar fibrótico no es un trastorno inflamatorio. Por ejemplo, el desarrollo de la enfermedad pulmonar fibrótica puede ser desencadenado por la transferencia adenovírica de TGF-β a los pulmones de animales que sólo presentan una respuesta inflamatoria transitoria. Estas nuevas ideas sugieren que la fibrosis pulmonar resulta de daños secuenciales a los pulmones a los que sigue una respuesta de cicatrización y no a lesiones crónicas. Por lo tanto, se establece una estrategia terapéutica basada en la modificación de la replicación de los fibroblásticos y de la deposición de la matriz. Sin embargo, no se ha observado ningún efecto clínico beneficioso en pacientes tras el tratamiento de colchicina (que interfiere con el procesamiento intracelular del colágeno) o el tratamiento de penicilamina (inhibidor del entrecruzamiento del colágeno) . Entre otros agentes incluidos en ensayos experimentales del bloqueo de la fibrogénesis se incluyen la pirfenidona, el interferón-γ o los anticuerpos contra la señalización de TGF-β (Giri, 2003) . En consecuencia, existe una necesidad de un modelo animal eficiente y fiable para el estudio de las enfermedades fibróticas, por ejemplo la fibrosis pulmonar, y para el ensayo de candidatos farmacológicos para el tratamiento de dichos trastornos.

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar un modelo animal para la enfermedad fibrótica, por ejemplo la fibrosis pulmonar que se desarrolla en el contexto de una enfermedad de tipo escleroderma (fibrosis generalizada)

o en otras enfermedades fibróticas.

La solución del problema subyacente a la invención se basa en los mecanismos moleculares asociados al factor de transcripción AP-1.

El factor de transcripción AP-1 es generado por una serie de dímeros de los productos de las familias de proteínas Fos, Jun y CREB/ATF (Eferl y Wagner, 2003) , así como otras proteínas bZip. Además, se han observado asociaciones entre Fos o Jun y la subunidad p65 de NFκB (Stein et al., 1993) y ATF-2 y p50-NFκB (Du et al., 1993) . La asociación combinatorial puede incluir tres genes Jun (c-jun, junB y junD) , cuatro genes Fos (c-fos, fosB, fra-1 y fra-2) y varios genes CREB/ATF (Eferl y Wagner, 2003) . A pesar del elevado grado de homología en las características estructurales globales, los diferentes miembros de las familias de Fos, Jun y CREB muestran diferencias significativas, que conducen a diferencias sutiles en la unión y activación transcripcional del ADN, lo que sugiere que los dímeros individuales presentan funciones específicas en la regulación génica (Jochum et al., 2001) . Los miembros de la familia de AP-1 participan en el control de la proliferación celular, así como en diversos tipos de diferenciación, y también en la función neural y en las respuestas al estrés. AP-1 es uno de los factores clave que traducen los estímulos externos en cambios tanto de corto como largo plazo de la expresión génica (Jochum et al., 2001) .

Se requieren miembros de las dos familias de proteínas, Jun y Fos, para la formación y remodelado óseo. La deleción parcial ubicua de un alelo c-jun condicional conduce a malformaciones del esqueleto axial (Behrens et al., 2003) y recientemente se ha demostrado que JunB es esencial para la proliferación y diferenciación de los osteoblastos (célula formadora de hueso) (Kenner et al., 2004) . La mayoría de las proteínas Fos participan... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Utilización de un roedor transgénico que comprende un vector transgénico, comprendiendo el vector transgénico: (i) el locus genómico fra-2, (ii) el promotor H2Kb, e (iii) una secuencia de repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma murino FBJ con una expresión ectópica generalizada o específica de tipo celular de fra-2 que se manifiesta en un fenotipo de enfermedad fibrótica, como modelo de enfermedades fibróticas.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho roedor es el ratón.

3. Utilización según la reivindicación 1 para enfermedades fibróticas humanas.

4. Utilización según la reivindicación 1 para la fibrosis generalizada de tipo escleroderma.

5. Utilización según la reivindicación 1 para la fibrosis pulmonar.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que dicho roedor transgénico expresa ectópicamente fra-2 en las células pulmonares.

7. Utilización según la reivindicación 1 para los trastornos fibróticos de la piel.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicho trastorno fibrótico de la piel es la formación excesiva de cicatriz.

9. Método para determinar el efecto de un compuesto de ensayo sobre una enfermedad fibrótica, que comprende poner en contacto el modelo según la reivindicación 1 con un compuesto de ensayo, medir la respuesta del roedor transgénico a dicho compuesto de ensayo y comparar la respuesta del mamífero transgénico con la respuesta de un animal de control.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la enfermedad fibrótica es la fibrosis generalizada de tipo escleroderma.

11. Método según la reivindicación 9, en el que dicha enfermedad fibrótica es la fibrosis pulmonar.

12. Método según la reivindicación 9, en el que la enfermedad fibrótica es un trastorno fibrótico de la piel.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho trastorno fibrótico de la piel es la formación excesiva de cicatriz.

14. Método para determinar el efecto de un compuesto de ensayo sobre una enfermedad fibrótica, que comprender poner en contacto células de ensayo que sobreexpresan fra-2, en el que las células de ensayo comprenden un vector transgénico, comprendiendo el vector transgénico: (i) el locus genómico fra-2, (ii) el promotor H2Kb, e (iii) una secuencia de repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma murino FBJ, y que se han obtenido del roedor transgénico según la reivindicación 2, con un compuesto de ensayo, medir el efecto de dicho compuesto de ensayo sobre dichas células de ensayo y comparar dicho efecto con el efecto de dicho compuesto de ensayo sobre células de control.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dichas células se han obtenido de un roedor transgénico con expresión ectópica de fra-2.

16. Método según la reivindicación 14, en el que la enfermedad fibrótica es la fibrosis generalizada de tipo escleroderma.

17. Método según la reivindicación 14, en el que dicha enfermedad fibrótica es la fibrosis pulmonar.

18. Método según la reivindicación 14, en el que la enfermedad fibrótica es un trastorno fibrótico de la piel.

19. Método según la reivindicación 14, en el que dicho trastorno fibrótico de la piel es la formación excesiva de cicatriz.

20. Método según la reivindicación 14, en el que dichas células son células hematopoyéticas.

21. Método según la reivindicación 14, en el que dichas células son células epiteliales pulmonares.

22. Método según la reivindicación 14, en el que dichas células son células mesenquimales. 11

23. Método según la reivindicación 22, en el que dichas células mesenquimales son fibroblastos o miofibroblastos.


 

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