Un agente citotóxico, que presenta un grupo conector de polietilen glicol (PEG) que tiene un éster activo terminal yde 1 a 1.

000 unidades monoméricas, de fórmula 2: **Fórmula**

en el que Z es un agente citotóxico que contiene tiol;

en el que Q es R2COO-, R2R3NCOO-, R2OCOO-, R2O-, R2CONR3

-, R2R3N-, R2OCONR3-, o S-,

en el que:

R2 es SCR4R5R6-,

R4, R5 y R6 son cada uno H, alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado y pueden ser el mismo o diferente,R3 es H o un alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado;

en el que n es un número entero de 0 a 999;

en el que x es 1 ó 2; y

en el que Y es N-succinimidilo, N-sulfosuccinimidilo, N-ftalimidilo, N-sulfoftalimidilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 2,4-dinitrofenilo, 3-sulfonil-4-nitrofenilo ó 3-carboxi-4-nitrofenilo.

Agentes citotóxicos que presentan un resto de polietilen glicol reactivo, conjugados citotóxicos que comprenden grupos conectores de polietilen glicol y métodos para preparar y usar los mismos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a agentes citotóxicos que presentan conectores de polietilen glicol reactivos y a métodos para preparar dichos agentes. Estos agentes pueden usarse en la producción de conjugados citotóxicos, o para otros propósitos, tales como en una resina de afinidad para uso en el aislamiento de componentes celulares que reconocen y se unen a los agentes citotóxicos.

La presente invención también se refiere a nuevos conjugados citotóxicos que comprenden conectores de polietilen glicol, a métodos para preparar los conjugados y a su uso terapéutico. Más específicamente, la invención se refiere a nuevos conjugados citotóxicos que comprenden agentes citotóxicos unidos a agentes de unión a células que usan conectores de polietilen glicol hetero-bifuncionales, a métodos para preparar los conjugados y a su uso terapéutico. Estos nuevos conjugados citotóxicos tienen uso terapéutico porque la parte citotóxica de los conjugados puede administrarse a poblaciones celulares específicas de una manera dirigida, debido a la unión del agente citotóxico con un agente de unión a células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se ha mostrado que los conjugados de agentes altamente citotóxicos, tales como maitansinoides y análogos de CC-1065, y agentes de unión a células poseen una actividad anti-tumoral excepcional específica de diana (Pat U.S. Nos: 5.208.020, 5.416.064, 5.475.092, 5.585.499 y 5.846.545) . En dichos conjugados citotóxicos, el agente citotóxico se une al agente de unión a células mediante un enlace disulfuro o mediante un conector corto que contiene disulfuro. Se ha mostrado previamente que dichos conectores que contienen disulfuro son estables después de almacenamiento y se escinden eficazmente en el interior de una célula tumoral para liberar el fármaco completamente activo (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8618-8623 (1996) ; Chari et al., Cancer Res. 55: 40794084 (1995) ; Chari, R. V. J., Adv. Drug Deliver y Rev. 31: 89-104 (1998) . La escisión ocurre probablemente mediante el intercambio de disulfuro entre el agente citotóxico unido a disulfuro y un tiol intracelular, tal como glutatión.

Sin embargo, como los agentes citotóxicos más altamente potentes usados en los conjugados citotóxicos son hidrofóbicos, surgen dos dificultades técnicas. La primera es que las reacciones de conjugación entre los agentes citotóxicos y los agentes de unión a células requieren condiciones de reacción que traten la naturaleza hidrofóbica de los agentes citotóxicos. Estas condiciones incluyen disoluciones muy diluidas, el uso de volúmenes grandes, y la presencia de grandes cantidades de co-disolventes no acuosos, que pueden dañar a los agentes de unión a células proteicos. Como resultado, los procesos de preparación y purificación se vuelven bastante engorrosos y el conjugado citotóxico final se obtiene en concentración baja, necesitando la administración de volúmenes grandes a los pacientes.

La segunda dificultad técnica es que los conjugados citotóxicos preparados usando enlaces disulfuro o conectores cortos que contienen disulfuro son sólo moderadamente solubles en las disoluciones farmacéuticas usadas típicamente para la administración parenteral a los pacientes. Es por lo tanto difícil producir formulaciones para dichos conjugados.

Así, con el fin de desarrollar métodos mejorados para producir conjugados citotóxicos, e incrementar la flexibilidad de la formulación de disoluciones farmacéuticas que contienen los conjugados, existe una necesidad de tratar la hidrofobicidad tanto de los agentes citotóxicos como de los conjugados citotóxicos producidos usando agentes citotóxicos.

Una manera para conseguir estos dos objetivos sería desarrollar moléculas conectoras nuevas que permitan que los agentes citotóxicos hidrofóbicos se puedan manipular bajo condiciones acuosas y permitan la formación de un conjugado citotóxico que sea soluble tanto bajo condiciones acuosas como no acuosas.

Se ha encontrado que el polietilen glicol (PEG) es útil en la conversión de fármacos citotóxicos en profármacos, extendiendo de esta manera la vida media de los fármacos en circulación in vivo, y mejorando su solubilidad en agua (para una revisión véase, Greenwald, R. B., J. Controlled Release 74: 159-171 (2001) ) . Por ejemplo, el fármaco anti-canceroso Taxol se ha convertido en el profármaco PEG-Taxol uniendo PEG mediante un enlace éster a la posición C-2’ del Taxol (Pat. U.S. No. 5.824.701; Greenwald et al., J. Med. Chem. 39: 424-431 (1996) ; Greenwald et al., J. Org. Chem. 60: 331-336 (1995) ) .

Sin embargo, el PEG usado en dichas aplicaciones es habitualmente muy grande (peso molecular medio de 40.000) . Dicho tamaño se requiere para alterar significativamente la farmacocinética del fármaco. Las moléculas de fármaco también se hacen reaccionar típicamente con PEG mediante un grupo éster o carbamato del fármaco, lo que puede resultar en una disminución drástica de la potencia del fármaco. Además, el resto de PEG debe

escindirse in vivo por algún mecanismo enzimático para restaurar la actividad del fármaco, un proceso que frecuentemente es ineficaz. Finalmente, el PEG usado en dichas aplicaciones es típicamente mono-funcional, es decir, sólo un extremo de la molécula de PEG se modifica de manera que pueda unirse al fármaco.

[00010] Los presentes inventores han preparado grupos conectores PEG nuevos que proporcionan una solución a las dos dificultades discutidas anteriormente. Estos grupos conectores PEG nuevos son solubles tanto en agua como en disolventes no acuosos, y pueden usarse para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión a células. Los grupos conectores PEG son conectores hetero-bifuncionales porque se unen a agentes citotóxicos y a agentes de unión a células en extremos opuestos de los conectores mediante un grupo sulfidrilo o disulfuro funcional en un extremo y un éster activo en el otro extremo. Los grupos conectores tienen la doble ventaja sobre otros grupos conectores de que (1) pueden unirse químicamente a un agente citotóxico en un disolvente no acuoso mediante un enlace disulfuro, superando de esta manera la naturaleza hidrofóbica del agente y haciéndolo soluble tanto en disolventes no acuosos como acuosos, y (2) los conjugados citotóxicos producidos usando los grupos conectores tienen una mayor solubilidad en agua, permitiendo de esta manera una flexibilidad mucho mayor en la formulación de disoluciones farmacéuticas para la administración parenteral a los pacientes.

[00011] Así, en la presente memoria se describen agentes citotóxicos que presentan un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal, y conjugados citotóxicos que comprenden uno o más agentes citotóxicos unidos a un agente de unión a células mediante un grupo conector PEG. Además, se describe una composición terapéutica que comprende un conjugado citotóxico.

[00012] También se describen métodos para preparar agentes citotóxicos que presentan un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal, y métodos para preparar conjugados citotóxicos que comprenden uno o más agentes citotóxicos unidos a un agente de unión a células mediante un grupo conector PEG. Finalmente, se describe un método para matar poblaciones celulares seleccionadas usando conjugados citotóxicos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[00013] En una realización de la invención, se describen agentes citotóxicos que presentan un grupo conector de polietilen glicol (PEG) que tiene un éster activo terminal. Los agentes citotóxicos contemplados en ésta, y en cada realización del procedimiento, incluyen un maitansinoide que contiene tiol, taxano que contiene tiol, análogo de CC1065 que contiene tiol, análogo de daunorrubicina que contiene tiol y análogo de doxorrubicina que contiene tiol y análogos o derivados que contienen tiol de éstos. El núcleo de los ésteres activos terminales del grupo conector PEG contemplados en ésta, y cada realización del procedimiento, son ésteres que reaccionan fácilmente con grupos amino, incluyendo ésteres de N-succinimidilo, N-sulfosuccinimidilo, N-ftalimidilo, N-sulfoftalimidilo, 2-nitrofenilo, 4nitrofenilo, 2, 4-dinitrofenilo, 3-sulfonil-4-nitrofenilo ó 3-carboxi-4-nitrofenilo.... [Seguir leyendo]

1. Un agente citotóxico, que presenta un grupo conector de polietilen glicol (PEG) que tiene un éster activo terminal y de 1 a 1.000 unidades monoméricas, de fórmula 2:

en el que Z es un agente citotóxico que contiene tiol; en el que Q es R2COO-, R2R3NCOO-, R2OCOO-, R2O-, R2CONR3-, R2R3N-, R2OCONR3-, o S-, en el que:

R2 es SCR4R5R6-,

R4, R5 y R6 son cada uno H, alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado y pueden ser el mismo o diferente, R3 es H o un alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado; en el que n es un número entero de 0 a 999; en el que x es 1 ó 2; y en el que Y es N-succinimidilo, N-sulfosuccinimidilo, N-ftalimidilo, N-sulfoftalimidilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 2, 4

dinitrofenilo, 3-sulfonil-4-nitrofenilo ó 3-carboxi-4-nitrofenilo.

2. El agente citotóxico de la reivindicación 1, en el que n es un número entero de 0 a 19, 20 a 39 ó 40 a 999.

3. El agente citotóxico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que Z-S es un maitansinoide que contiene tiol, un taxano que contiene tiol, un análogo de CC-1065 que contiene tiol, un análogo de daunorrubicina que contiene tiol o un análogo de doxorrubicina que contiene tiol o derivados de éstos.

4. Un conjugado citotóxico, que tiene uno o más agentes citotóxicos unidos covalentemente a un agente de unión a células mediante un grupo conector PEG que tiene de 1 a 1.000 unidades monoméricas, en el que una unión de uno de dichos uno o más agentes citotóxicos se ilustra en la fórmula 3:

en el que Z-S es un agente citotóxico que contiene tiol; en el que Q es R2COO-, R2R3NCOO-, R2OCOO-, R2O-, R2CONR3-, R2R3N-, R2OCONR3-, o S-, en el que: R2 es SCR4R5R6-, R4, R5 y R6 son cada uno H, alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado y pueden ser el mismo o diferente, R3 es H o un alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado, en el que n es un número entero de 0 a 999; en el que x es 1 ó 2; y en el que A es dicho agente de unión a células.

5. El conjugado citotóxico de la reivindicación 4 en el que n es un número entero de 0 a 19, 20 a 39 ó 40 a 999.

6. El conjugado citotóxico de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que Z-S es un maitansinoide que contiene tiol, un taxano que contiene tiol, un análogo de CC-1065 que contiene tiol, un análogo de daunorrubicina que contiene tiol o un análogo de doxorrubicina que contiene tiol o derivados de éstos.

7. El conjugado citotóxico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el agente de unión a células se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de éstos, interferones, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas y moléculas transportadoras de nutrientes.

8. El conjugado citotóxico de la reivindicación 7, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo de éstos.

9. Un método para producir un agente citotóxico, que presenta un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal y 1 a 1.000 unidades monoméricas, de fórmula 2 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) hacer reaccionar un grupo conector PEG que tiene 1 a 1.000 unidades monoméricas de fórmula 1:

en el que R’ es 2-piridilo, 4-piridilo, 5-nitro-2-piridilo, 5-nitro-4-piridilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo ó 2, 4-dinitrofenilo; y

en el que R es H, un catión para formar una sal o un grupo químico para formar un éster, con un agente citotóxico que contiene tiol, y

b) convertir el grupo R del producto de la etapa a) en un éster activo, produciendo de esta manera un agente citotóxico que presenta un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal y 1 a 1.000 unidades monoméricas.

10. Un método para producir un conjugado citotóxico que tiene uno o más agentes citotóxicos unidos covalentemente a un agente de unión a células mediante un grupo conector PEG que tiene 1 a 1.000 unidades monoméricas, comprendiendo dicho método hacer reaccionar uno o más agentes citotóxicos con un agente de unión a células, en el que dicho uno o más agentes citotóxicos presenta cada uno un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal y 1 a 1.000 unidades monoméricas, y en el que dicho agente citotóxico que presenta un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal y 1 a 1.000 unidades monoméricas es un compuesto de fórmula 2:

en el que Z-S es un agente citotóxico que contiene tiol; en el que Q es R2COO-, R2R3NCOO-, R2OCOO-, R2O-, R2CONR3-, R2R3N-, R2OCONR3-, o S-, en el que:

R2 es SCR4R5R6-,

R4, R5 y R6 son cada uno H, alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado y pueden ser el mismo o diferente, R3 es H o un alquilo lineal, alquilo cíclico o alquilo ramificado; en el que n es un número entero de 0 a 999; en el que x es 1 ó 2; y en el que Y es N-succinimidilo, N-sulfosuccinimidilo, N-ftalimidilo, N-sulfoftalimidilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 2, 4

dinitrofenilo, 3-sulfonil-4-nitrofenilo ó 3-carboxi-4-nitrofenilo, produciendo de esta manera un conjugado citotóxico de fórmula 3 con una unión de uno de dichos uno o más agentes citotóxicos

en el que A es dicho agente de unión a células.

11. El método de la reivindicación 10, en el que n es un número entero de 0 a 19, 20 a 39 ó 40 a 999.

12. El método según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que dicho método comprende además la etapa inicial de preparar un agente citotóxico, que presenta un grupo conector PEG que tiene un éster activo terminal, comprendiendo dicha etapa inicial hacer reaccionar un agente citotóxico que contiene tiol con un grupo conector PEG de fórmula 1:

en el que R’ es 2-piridilo, 4-piridilo, 5-nitro-2-piridilo, 5-nitro-4-piridilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo ó 2, 4-dinitrofenilo; y

en el que R es H, un catión para formar una sal o un grupo químico para formar un éster.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que Z-S es un maitansinoide que contiene tiol, un taxano que contiene tiol, un análogo de CC-1065 que contiene tiol, un análogo de daunorrubicina que contiene tiol o un análogo de doxorrubicina que contiene tiol o derivados de éstos.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el agente de unión a células se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de éstos, interferones, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas y moléculas transportadoras de nutrientes.

15. El método de la reivindicación 14, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo de éstos.

16. Una composición terapéutica que comprende:

(A) una cantidad eficaz de uno o más conjugados citotóxicos de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, y

(B) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Un método para matar poblaciones celulares seleccionadas in vitro o ex vivo que comprende poner en contacto células diana, o tejido que contiene células diana, con una cantidad eficaz del conjugado citotóxico de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o agente terapéutico o composición de la reivindicación 16.

18. El método de la reivindicación 17, que es un método para tratar una afección médica que es una malignidad, una enfermedad autoinmune, un rechazo de injerto, enfermedad de injerto frente a huésped, una infección viral o una infección por parásitos.

19. El método de la reivindicación 18, en el que la afección médica es cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, ovario u órganos linfáticos.

20. Un conjugado citotóxico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o composición terapéutica de la reivindicación 16, para uso terapéutico.

21. Un conjugado citotóxico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o composición terapéutica de la reivindicación 16, para uso en un método in vivo para inducir la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas que comprende poner en contacto células diana, o tejido que contiene células diana, con una cantidad eficaz de un agente citotóxico.

22. El conjugado citotóxico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o composición terapéutica de la reivindicación 16, para uso en un método in vivo para tratar una afección médica que es una malignidad, una enfermedad autoinmune, un rechazo de injerto, enfermedad de injerto frente a huésped, una infección viral o una infección por parásitos.

23. El conjugado citotóxico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o composición terapéutica de la reivindicación 16, para uso en el método in vivo de la reivindicación 22, en el que el método es para tratar una afección médica que es cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, ovario u órganos linfáticos.

24. Uso de un conjugado citotóxico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o composición terapéutica de la reivindicación 16, en la fabricación de un medicamento para uso en un método in vivo para inducir la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23.