ADN DE MEMBRANA DESMETILADO Y/U OXIDADO Y USO DEL MISMO EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES.
Un procedimiento para la preparación de ADN de membrana (ADNm) oxidado y/o desmetilado que comprende las etapas de
- tratar una célula con un factor de estrés seleccionado del grupo que consiste en irradiación UV,
reactivos oxidantes, sales de metales pesados, fármacos, análogos nucleosídicos y nucleotídicos, inhibidores de enzima y cambio de pH
- lisis de la célula para dar un lisado celular
- purificación del ADNm oxidado y/o desmetilado a partir del lisado celular.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2003/011293.
Solicitante: BIOTECH TOOLS S.A.
Nacionalidad solicitante: Bélgica.
Dirección: RUE DE RANSBEEK 230, BLOC V 1120 BRUXELLES BELGICA.
Inventor/es: HENOT,Frédéric, LEGON,Thierry, QUESTIAUX,Nadine.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07H21/00 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos.
- C07H21/04 C07H […] › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/564 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para complejos inmunológicos preexistentes o enfermedades autoinmunes.
PDF original: ES-2375721_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
ADN de membrana desmetilado y/u oxidado y uso del mismo en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ADN asociado a la membrana citoplásmica oxidado y/o desmetilado (cADNm) o ADN de membrana (ADNm) y ADNm oxidado y/o desmetilado.
También se refiere a una célula que comprende el ADN de membrana oxidado y/o desmetilado y al uso diagnóstico y farmacéutico del ADN de membrana oxidado y/o desmetilado y a las células que comprenden tal ADNm.
Antecedentes de la invención El documento US 6.057.097, incorporado por referencia, divulgó marcadores para patologías que comprenden una reacción autoinmune y marcadores para enfermedades inflamatorias.
Como se desvela en el presente documento, numerosas patologías que comprenden una reacción autoinmune y enfermedades inflamatorias tienen una etiología dudosa o desconocida y pueden tener un origen multifactorial.
El diagnóstico de algunas de estas enfermedades es difícil o dudoso. Una enfermedad especialmente mencionada en el presente documento es el lupus eritematoso sistémico (SLE) . Antes del documento US 6.057.097 no había sido posible proporcionar una estructura antigénica específica suficiente para obtener un diagnóstico confiable tanto en especificidad como sensibilidad para las mencionadas patologías, en especial el SLE.
El documento US 6.057.097 resuelve el problema suministrando una estructura antigénica denominada ADN asociado a membrana citoplásmica (cADNm) o ADN de membrana (ADNm) .
Este antígeno es reconocido por los anticuerpos presentes en los fluidos biológicos de sujetos que sufren de las enfermedades mencionadas. Esta estructura antigénica se prepara a partir de células, especialmente de linfocitos 1B tales como las células Wil-2.
El objetivo de la presente es proporcionar una estructura antigénica mejorada y de este modo una mejor herramienta diagnóstica que demuestre una mayor especificidad y sensibilidad.
Un objetivo adicional es proporcionar un procedimiento de selección para sustancias farmacéuticas útiles en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes y/o inflamaciones.
Un objetivo adicional es proporcionar una composición farmacéutica.
Sumario de la invención De acuerdo con la invención, la estructura antigénica se prepara por un procedimiento para la preparación de ADN de membrana en una condición oxidada y/o desmetilada.
Este procedimiento comprende las etapas de
• tratar una célula con un factor de estrés seleccionado del grupo que consiste en irradiación UV, reactivos oxidantes, sales de metales pesados, fármacos, análogos nucleosídicos y nucleotídicos, inhibidores enzimáticos, activadores enzimáticos y cambio de pH
• lisis de la célula para dar un lisado celular
• purificación del ADN de membrana oxidado y/o desmetilado a partir del lisado celular.
Se considera que el tratamiento con factores de estrés aumenta la cantidad de ADN de membrana oxidado y/o aumenta la desmetilación del ADN de membrana en la célula. Posteriormente, el ADN se aísla de una manera similar a la previamente conocida a partir del documento US 6.057.097.
"ADN de membrana oxidado y/o desmetilado" es ADNm que está oxidado o desmetilado, o ambos.
"ADN de membrana oxidado" es ADN de membrana que comprende más nucleótidos oxidados en relación con el ADNm de células no tratadas con los factores de estrés. Dichos nucleótidos oxidados pueden ser, por ejemplo, 5hidroximetil-2'-desoxiuridina y/o timidina glicol y/o 7, 8-dihidroxi-8-oxoadenosina y/u 8-oxo-7, 8-dihidro-2'desoxiguanosina.
El nucleótido oxidado más abundante es la 8-oxo-7, 8-dihidro-2'-desoxiguaniosina (8-oxo-dG) . El ADNm oxidado puede comprender preferentemente más de 0, 5%, más preferentemente más de 1%, con máxima preferencia más de 3% de toda la guanosina en forma oxidada.
"ADNm desmetilado" es un ADNm que comprende menos nucleótidos metilados que el ADN preparado a partir de las células sin tratamiento con un factor de estrés.
El nucleótido metilado es usualmente citosina. Tal metilación se produce sobre todo en el contexto de dinucleótidos CpG en vertebrados y a menudo está asociada con la represión de la transcripción.
Preferiblemente, la cantidad de citosina 5-metilada es menor del 90% del ADNm no tratado, más preferentemente 50% o menor y con máxima preferencia 30% o menor.
También se cree que el tratamiento con factores de estrés, tales como, sin limitación, estrés oxidativo, puede generar transversiones o mutaciones, tales como, sin limitación, G a T, en la secuencia del ADN de membrana en la célula. En consecuencia, "ADN de membrana oxidado y/o desmetilado" puede ser ADN de membrana que comprende al menos las mismas cantidades de nucleótidos oxidados y/o metilados en relación con el ADNm de las células no tratadas con factores de estrés, pero con una secuencia de nucleótidos diferente.
Los factores de estrés adecuados son, por ejemplo, dicromato, peróxido de hidrógeno, permanganato, quinidina, Dpencilamina, hidralazina, procainamida, metabolitos de ARN/ADN, análogos nucleosídicos y nucleotídicos tales como 5-aza-citidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, inhibidores de metilasas del ADN, inhibidores de histona desacetilasas tales como butiratos o tricostatina A, inhibidores de histona acetiltransferasas, inhibidores de histona arginina e histona lisina metiltransferasas, inhibidores de proteína quinasas tales como estaurosporina o calfostina C o K-252a o H-89, activadores de proteína quinasas tales como ésteres de forbol o briostatina 1, inhibidores de proteína fosfatasas tales como caliculina A o ácido okadaico, inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa tales como 3aminobenzamida o m-yodobencilguanidina hemisulfato, inhibidores de enzimas conjugadoras de ubiquitinas tales como ubiquitina metilada, inhibidores de ubiquitina C-terminal hidrolasa tales como ubiquitina aldehído, inhibidores de enzimas involucradas en la corrección de errores de replicación y/o daño espontáneo del ADN tales como los iones cadmio, inhibidores de la N- glicosilación tales como tunicamicina, inhibidores de los proteasomas 20S o 26S tales como la lactacistina, inhibidores de la farnesilación tales como el ácido alfa-hidroxi-farnesilfosfónico, inhibidores de la geranilgeranilación, inhibidores de la metilación de proteínas tales como la ebelactona B, inhibidores de la catalasa, inhibidores de la superóxido dismutasa, inhibidores de la glutatión peroxidasa, inductores de la hipermetilación del ADN, inductores de la metilación de los fosfolípidos, inhibidores de la metilación de los fosfolípidos tales como la 3-deazaadenosina o la 3-deaza- (±) -aristeromicina, o combinaciones de los mismos.
Un factor de estrés adecuados adicional es un cambio de pH. Un cambio de pH es un cambio del pH del ambiente de al menos 0, 2 unidades de pH, preferentemente 0, 4 unidades de pH.
Un factor de estrés adecuado adicional es, por ejemplo, la irradiación UV. La irradiación UV preferentemente se combina con reactivos oxidantes.
Los reactivos oxidantes adecuados son, por ejemplo, H2O2 o el oxígeno molecular.
A partir del oxígeno molecular, se pueden obtener especies activas tales como el radical superóxido (O2-•) y el radical hidroxilo - (HO•) ; véase, por ejemplo, "Proceedings of the society for experimental biology and medicine" 1999, páginas 246 a 252. Los metales pesados adecuados son sales de cadmio, sales de cromo o mezclas de las mismas. Se pueden usar solas o en combinación con los reactivos oxidantes, por ejemplo O2 o H2O2.
Una realización adicional de la presente invención es el ADN de membrana (ADNm) oxidado y/o desmetilado que se puede obtener de acuerdo con el procedimiento de la invención.
Tal ADN de membrana oxidado y/o desmetilado o fragmentos del mismo son útiles como una estructura antigénica en una prueba diagnóstica de enfermedades autoinmunes. Los fragmentos del ADNm o fragmentos de ADN de membrana oxidado y/o desmetilado se pueden obtener por procedimientos conocidos en la técnica tales como, sin limitación, sonicación, digestión enzimática con nucleasas y/o enzimas de restricción.
En otra realización el ADN de membrana oxidado y/o desmetilado o fragmentos del mismo también se asocian con proteínas de unión al ADN, con máxima... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para la preparación de ADN de membrana (ADNm) oxidado y/o desmetilado que comprende las etapas de
• tratar una célula con un factor de estrés seleccionado del grupo que consiste en irradiación UV, reactivos oxidantes, sales de metales pesados, fármacos, análogos nucleosídicos y nucleotídicos, inhibidores de enzima y cambio de pH
• lisis de la célula para dar un lisado celular
• purificación del ADNm oxidado y/o desmetilado a partir del lisado celular.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el factor de estrés se selecciona de dicromato, peróxido de hidrógeno, permanganato, quinidina, D-pencilamina, hidralazina, procainamida, metabolitos de ARN/ADN, análogos nucleosídicos y nucleotídicos tales como 5-aza-citidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, inhibidores de ADN metilasas, inhibidores de histona desacetilasas tales como butiratos o tricostatina A, inhibidores de histona acetiltransferasas, inhibidores de histona arginina e histona lisina metiltransferasas, inhibidores de proteína quinasas tales como estaurosporina o calfostina C o K-252a o H-89, activadores de proteína quinasas tales como ésteres de forbol o briostatina 1, inhibidores de proteína fosfatasas tales como caliculina A o ácido okadaico, inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa tales como 3-aminobenzamida o m-yodobencilguanidina hemisulfato, inhibidores de enzimas conjugadoras de ubiquitinas tales como ubiquitina metilada, inhibidores de la ubiquitina C-terminal hidrolasa tales como ubiquitina aldehído, inhibidores de enzimas involucradas en la corrección de errores de replicación y/o daño espontáneo del ADN tales como iones cadmio, inhibidores de la N-glicosilación tales como tunicamicina, inhibidores de 20S o 26S proteasomas tales como lactacistina, inhibidores de la farnesilación tales como el ácido alfa-hidroxi-farnesilfosfónico, inhibidores de la geranilgeranilación, inhibidores de la metilación de proteínas tales como la ebelactona B, inhibidores de la catalasa, inhibidores de la superóxido dismutasa, inhibidores de la glutatión peroxidasa, inductores de la hipermetilación del ADN, inductores de la metilación de los fosfolípidos, inhibidores de la metilación de los fosfolípidos tales como la 3-deazaadenosina o 3-deaza- (±) -aristeromicina, o combinaciones de los mismos.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ADNm oxidado y/o desmetilado se asocia con proteínas de unión a ácidos nucleicos.
4. ADN de membrana (ADNm) oxidado y/o desmetilado que se puede obtener de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. ADNm de acuerdo con la reivindicación 4 asociado con proteínas de unión al ADN, en especial histonas.
6. ADNm de acuerdo con la reivindicación 5, en el que las proteínas de unión al ADN son hipo- o hiperacetiladas y/o hipo- o hiperfosforiladas, y/o hipo- o hipermetiladas, y/o hipo- o hiper-ubiquitinadas, y/o hipo- o hiper- (poli-ADPribosiladas) , y/o hipo- o hipergligosiladas, o sus combinaciones.
7. Un agente diagnóstico que comprende el ADNm de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o células que se pueden obtener por un procedimiento para preparar células que comprenden ADN de membrana oxidado y/o desmetilado, que comprende la etapa de tratar una célula con un factor de estrés seleccionado del grupo que consiste en irradiación UV, reactivos oxidantes, sales de metales pesados, fármacos, análogos nucleosídicos y nucleotídicos, inhibidores enzimáticos, activadores enzimáticos y cambio de pH, en el que el tratamiento con los factores de estrés aumenta la cantidad de ADN de membrana oxidado y/o aumenta la desmetilación del ADN de membrana en la célula.
8. Un procedimiento para la detección in vitro de lupus eritematoso sistémico (SLE) que comprende las etapas de
• poner un fluido biológico de un animal que contiene anticuerpos en contacto con el agente diagnóstico de la reivindicación 7
• medir la unión de dichos anticuerpos con dicho agente diagnóstico, donde la unión indica una enfermedad del animal.
9. Un procedimiento para la detección in vitro del lupus eritematoso sistémico (SLE) que comprende las etapas de
• poner una muestra biológica de un animal que contiene células en contacto con anticuerpos dirigidos contra el ADNm oxidado y/o desmetilado de la reivindicación 4
• medir la unión de dichos anticuerpos con dichas células
en el que la unión indica una enfermedad del animal.
10. Uso del agente diagnóstico de la reivindicación 7 para detectar la unión de los anticuerpos al ADNm in vitro.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la unión de los anticuerpos de un animal indica una enfermedad autoinmune del animal.
12. Un procedimiento para seleccionar fármacos por medición de la unión de los anticuerpos al ADNm de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en presencia de un fármaco.
13. Una formulación farmacéutica que comprende el ADNm de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
14. La formulación farmacéutica de la reivindicación 13 en forma de vacuna.
15. Uso del ADNm de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la preparación de un medicamento para tratar enfermedades autoinmunes en un animal.
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