Un método para identificar un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO:

6 o un homólogo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinación, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o dicho homólogo del mismo; (ii) medir el enlace de ubiquitina a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B, en donde la detección de la ubiquitina enlazada a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B es indicativa de que dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B tiene actividad relacionada con ubiquitinación

Actividad relacionada con ubiquitinaci6n y/o degradaci6n de SIVA y moduladores de la misma.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invenci6n se refiere a la actividad relacionada con ubiquitinaci6n y/o degradaci6n de un polipeptido SIVA 5 y a agentes capaces de modular dicha actividad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

SIVA es una proteina adaptadora que se fija a la cola citoplasmica de los receptores CD27 y GITR de la familia de receptores TNF (TNFR) . La misma existe como dos isoformas alternativas de corte y empalme, SIVA1 y SIVA2. SIVA1 es mas larga y contiene una regi6n de homologia de dominio de muerte (DDHR) con una helice anfipatica supuesta en su parte central. SIVA2 es mas corta y carece de la DDHR. Ambas isoformas contienen un dedo de anillo semejante a caja B y un dominio semejante a un dedo de cinc en sus terminos C. Borden et al., 1995 proporciona datos estructurales del dominio de caja B en el factor nuclear de Xenopus, XNF7.

Se ha demostrado que la expresi6n forzada tanto de SIVA1 como de SIVA2 induce apoptosis (Prasad et al., 1997, Yoon et al., 1998, Spinicelli et al., 2003 (Py et al., 2004) . Se ha sugerido que la apoptosis inducida por SIVA1 es efectuada por su fijaci6n a e inhibici6n de los miembros antiapopt6ticos de la familia Bcl2 a traves de su regi6n helicoidal anfipatica (Chu et al., 2005; Chu et al., 2004; Xue et al., 2002) . Consistentemente con el papel proapopt6tico, SIVA es una diana transcripcional directa para los supresores de tumores p53 y E2F1 (Fortin et al., 2004) . Diversas evidencias indican que SIVA es una proteina inducida por estres y esta regulada en sentido creciente en la lesi6n isquemica aguda (Palanilam et al., 1998) , la infecci6n de coxavirus (Henke et al., 2000) , y tambien por tratamiento con cisplatino (Qin et al., 2002) , asi como la expresi6n de TIP30 que induce apoptosis (Xiao et al., 2000) . Recientemente, se ha demostrado que los terminos N y C comunes de SIVA1 y SIVA2, pero no el dominio de muerte, son suficientes y capaces de mediar apoptosis en celulas linfoides por activaci6n de un camino mitocondrial dependiente de caspasas (Py et al., 2004) .

La quinasa inductora de NFKB, NIK (MAP3K14) fue descubierta (Malinin et al., 1997) en un cribado de proteinas que se fijan a la proteina adaptadora asociada al receptor TNF, TRAF2. La activaci6n acusada de NFKB por sobreexpresi6n de esta proteina quinasa, y la inhibici6n efectiva de la activaci6n de NFKB en respuesta a una diversidad de proteinaquinasas, asi como la inhibici6n efectiva de la activaci6n de NFKB en respuesta a una diversidad de agentes inductores, despues de la expresi6n de mutantes de NIK cataliticamente inactivos sugirieron que NIK participa en la senalizaci6n para la activaci6n de NFKB (Malinin et al., 1997) .

NIK tiene un desarrollo en los 6rganos linfoides (Shinkura et al., 1999) . Aparte de la contribuci6n a la regulaci6n del desarrollo y la funci6n del sistema inmunitario, parece ser que NIK esta implicada tambien en la regulaci6n de diversas funciones no inmunitarias tales como el desarrollo de las glandulas mamarias (Miyawaki et al., 1994) . Estudios in vitro implicaron NIK en la senalizaci6n que conduce a la diferenciaci6n de las celulas musculares esqueleticas (Canicio et al., 2001) , y en la supervivencia y diferenciaci6n de las neuronas (Foehr et al., 2006) .

La evaluaci6n del patr6n de las especies NFKB en los 6rganos linfoides indic6 que, aparte de su papel en la regulaci6n del o de los complejos de NFKB constituidos por proteinas Rel e IKB, NIK participa tambien en el control de la expresi6n/activaci6n de otras especies NFKB. De hecho, se ha demostrado que NIK participa en la fosforilaci6n de p100 de acci6n especifica, que sirve como disparador molecular para la ubiquitinaci6n y el procesamiento activo de p100 para formar p52. Se ha encontrado que esta actividad de procesamiento de p100 es anulada por la mutaci6n aly de NIK (Xiao et al., 2001b) .

En el estroma timico, NIK es importante para la producci6n normal de celulas Treg, que son esenciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunol6gica. La mutaci6n de NIK daba como resultado una estructura timica desorganizada y empeoraba la producci6n de celulas Treg en los ratones aly (Kajiura et al., 2004) . Consistentemente, estudios de ratones deficientes en NIK sugerian tambien un papel para NIK en el control del desarrollo y la expansi6n de las 45 celulas Treg (Lu et al., 2005) . Estos descubrimientos sugieren un papel esencial de NIK en el establecimiento de la autotolerancia de una manera dependiente del estroma. NIK participa tambien en la activaci6n de NFKB como consecuencia de infecci6n viral. La infecci6n por el virus respiratorio sincitial da como resultado una actividad incrementada de quinasas de NIK y la formaci6n de un complejo constituido por NIK activada, IKK1, p100 y la p52 procesada en las celulas a549 semejantes a alveolos. En este caso, NIK llega a autotranslocarse al nucleo fijado a p52 y, sor

50 prendentemente, estos sucesos preceden a la activaci6n del camino can6nico de NFKB (Choudhar y et al., 2005) . Estos descubrimientos indican que NIK actua de hecho como mediador de la activaci6n de NFKB, pero puede desempenar tambien otras funciones, y que ejerce estas funciones de una manera especifica de la celula y el receptor.

NIK puede activarse como consecuencia de fosforilaci6n del 'bucle de activaci6n' dentro de la molecula NIK. De hecho, la mutaci6n de un sitio de fosforilaci6n dentro de este bucle (Thr559) impide la activaci6n de NFKB despues 55 de sobreexpresi6n de NIK (Lin et al., 1999) . Adicionalmente, la actividad de NIK parece estar regulada por la capacidad de las regiones situadas aguas arriba y aguas abajo de su motivo quinasa para unirse una a otra. Se ha demostrado que la regi6n C terminal de NIK aguas abajo de su resto quinasa es capaz de fijarse directamente a IKK1

(Regnier et al., 1997) asi como a p100 (Xiao et al., 2001b) , y estas interacciones son necesarias aparentemente para la funci6n de NIK en la senalizaci6n de NFKB. La regi6n N terminal de NIK contiene un dominio regulador negativo (NRD) , que esta compuesto de un motivo basico (BR) y un motivo de repetici6n rico en prolina (PRR) (Xiao y Sun, 2000) . El NRD Nterminal interacciona con la regi6n Cterminal de NIK en cis, impidiendo con ello la fijaci6n de NIK a su sustrato (IKK1 y p100) . La NIK expresada ect6picamente forma de modo espontaneo olig6meros en los cuales estas uniones de las regiones Nterminales a las Cterminales en cada molecula de NIK estan aparentemente rotas, y presentan un nivel elevado de actividad constitutiva (Lin et al., 1999) . La fijaci6n de la regi6n Cterminal de NIK a TRAF2 (asi como a otras TRAF's) participa muy probablemente en el proceso de activaci6n. Sin embargo, su modo de participaci6n exacto se desconoce.

Recientemente, ha ganado mucha atenci6n un nuevo mecanismo de regulaci6n de NIK. Este se refiere a la interacci6n dinamica de NIK y TRAF3 que conduce a degradaci6n de NIK mediada por proteasomas. Es interesante que se ha demostrado que los inductores del camino alternativo de NFKB, como CD40 y BLyS, inducen la degradaci6n de TRAF3 y la mejora concomitante de la expresi6n de NIK (Liao et al., 2004) .

Existe todavia informaci6n mas bien limitada de los mecanismos aguas abajo en la acci6n de NIK. Se han presentado pruebas de que NIK, por la fijaci6n de su regi6n Cterminal a IKK1, puede activar el complejo IKBquinasa (IKK) . De hecho, se ha demostrado que es capaz de fosforilar la serina 176 en el bucle de activaci6n de IKK1 y por consiguiente su activaci6n (Ling et al., 1998) .

Se ha sugerido que NIK no participa en absoluto en el camino NFKB can6nico, sino que mas bien sirve exclusivamente para activar el camino alternativo (vease Pomerantz y Baltimore, 2002, para revisi6n) .

Finalmente, se demostr6 que aunque la inducci6n de la degradaci6n de IkappaB en los linfocitos por TNF es independiente de NIK, su inducci6n por CD70, ligando CD40, y BLyS/FAFF, que inducen tambien el procesamiento de NFKB2/p100, depende de hecho de la funci6n de NIK (Ramakrishnan et al. 2004) . Tanto CD70 como TNF inducen reclutamiento del complejo de quinasas IKK en sus receptores. En el caso de CD70, pero no de TNF, este proceso esta asociado con reclutamiento de NIK y va seguido por una asociaci6n prolongada de receptores de IKK1 y NIK. El reclutamiento del complejo de IKK en CD27, pero no el de NIK, depende de la funci6n de la quinasa NIK. Estos descubrimientos indican que NIK participa en una serie unica de sucesos de senalizaci6n proximales iniciados por inductores especificos, que activan los dimeros NFkappaB... [Seguir leyendo]

1.Un metodo para identificar un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o dicho hom6logo del mismo; (ii) medir el enlace de ubiquitina a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B, en donde la detecci6n de la ubiquitina enlazada a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B es indicativa de que dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.

2.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en donde el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 es un polipeptido SIVA.

3.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en donde el metodo tiene por objeto la identificaci6n de un polipeptido SIVA capaz de tener actividad relacionada con la ubiquitinaci6n K63.

4.Un metodo para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n directa o indirecta que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, un polipeptido TRAF2, y opcionalmente un E3 en presencia o ausencia de un polipeptido SIVA; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n del polipeptido TRAF2 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF2 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA, en donde el aumento en el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF2 en presencia del polipeptido SIVA es indicativo de que el polipeptido SIVA tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n.

5.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en donde se testa la actividad relacionada con la ubiquitinaci6n K48 de un polipeptido SIVA.

6.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4 6 5, en donde el polipeptido SIVA consiste en SIVA2.

7.Un metodo para identificaci6n de un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, E2, el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo en presencia o en ausencia de un agente candidato, en condiciones que permiten la ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un polipeptido de anillo semejante a caja B mediada por dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B en presencia o en ausencia de dicho agente candidato; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n en presencia y en ausencia de dicho agente candidato, en donde un cambio en el nivel de ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un polipeptido de anillo semejante a caja B en presencia de dicho agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B.

8.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 7, en donde el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 es un polipeptido SIVA.

9.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 2 u 8, en donde la ubiquitina es ubiquitina mutada en K48.

10.El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la puesta en contacto de los polipeptidos se lleva a cabo en el interior de celulas o in vitro.

11.El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la ubiquitinaci6n se detecta por analisis de transferencia Western.

12.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 7 u 8, en donde dicho agente candidato se selecciona de moleculas organicas pequenas, peptidos, acidos nucleicos, moleculas procedentes de extractos naturales, y compuestos organicos sinteticos.

13.Un polipeptido aislado constituido por una caja B de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 6.

14.Un polipeptido aislado constituido por un fragmento Cterminal de un polipeptido SIVA que incluye el dedo de anillo semejante a caja B y/o el motivo con dedo de cinc, en donde el fragmento esta constituido por los residuos de aminoacidos 58 a 110 de SIVA2 indicados en SEQ ID NO: 3.

15.Un polinucle6tido aislado que codifica un polipeptido de acuerdo con las reivindicaciones 13 6 14.

16.Un polinucle6tido aislado de acuerdo con la reivindicaci6n 15, que comprende la secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

17.Un vector que comprende un polinucle6tido de acuerdo con las reivindicaciones 15 6 16. 18.Una celula hospedadora que alberga un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 17. 19.Un metodo para preparaci6n de un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 6 14, que comprende cultivar una celula hospedadora de acuerdo con la reivindicaci6n 18 y aislar el polipeptido producido.

20.Un kit util para ubiquitinaci6n de un sustrato proteinico que comprende E1, E2, ubiquitina, y un polipeptido SIVA.

21.El kit de acuerdo con la reivindicaci6n 20, en donde el sustrato proteinico se selecciona de TRAF2, TRAF3, NIK y SIVA. 22.Una composici6n farmaceutica que comprende un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 17, un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 6 14 o una sal del mismo, o un polinucle6tido de acuerdo con 10 la reivindicaci6n 15 6 16 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Ensayo de quinasas in vitro Lisado total Ensayo de quinasas in vitro Lisados totales 60

Doxi Citoplasma Nucleo Doxi de la entrada

Lisado total Lisado total

Lisado total