ÁCIDOS RIBONUCLEICOS PEQUEÑOS DE INTERFERENCIA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ALÉRGICAS.

Ácidos ribonucleicos pequeños de interferencia para el tratamiento de enfermedades alérgicas Campo de la invención La presente invención se refiere a tratamientos de enfermedades alérgicas. Más particularmente, la presente invención proporciona compuestos, procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades alérgicas 5 mediante la supresión de la expresión de los genes relacionados con la inflamación de las vías respiratorias a través de interferencias mediadas por ARN. Antecedentes de la invención El aumento de la prevalencia de las enfermedades alérgicas se ha apreciado en los países más desarrollados y en desarrollo. Las enfermedades alérgicas se definen como alteraciones funcionales causadas por hipersensibilidad de tipo I, es decir, respuesta inmune de tipo I mediada por anticuerpos IgE. Los síntomas incluyen polinosis, asma bronquial, rinitis alérgica, sinusitis, síndrome de distrés respiratorio, dermatitis atópica y choque anafiláctico. Actualmente, las enfermedades alérgicas tienden a ser más graves en las sociedades civilizadas y tienen un gran coste. Entre la gente que padece diversos síntomas alérgicos, la rinitis alérgica es la forma de alergia más común. Además, el ataque de alergenos a veces puede ser mortal. De acuerdo con datos estadísticos de 1994 realizados por el Departamento de Pediatría del Colegio Médico de la Universidad Nacional de Taiwán, la tasa de prevalencia de la rinitis alérgica entre los estudiantes de la ciudad de Taipei (Taiwán) está sobre el 33%, aproximadamente 3 veces mayor que la del asma (10~11%). El número de pacientes también aumenta cada año. En particular, los pacientes niños pequeños son los que más rápido aumentan. Por lo tanto muchos investigadores se están dedicando a desarrollar una solución mejorada para reducir la carga económica y física del paciente de dichas enfermedades alérgicas. En los últimos años, con el uso emergente de la tecnología de silenciación del gen post-transcripcional, en particular, la interferencia de ARN (ARNi), como una herramienta para eliminar la expresión de genes específicos en una diversidad de organismos (Mello y Conte, "Revealing the world of RNA interference", (2004) Nature 431, 338-342; y Scherer y Rossi, "Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA", (2003) Nature Biotechnology, 21, 1457- 1465), actualmente es posible mapear las interacciones de proteínas en rutas de señalización celular mediante la silenciación sistemática de genes funcionales, y proporcionar de esta manera una nueva manera de desarrollar terapias para innumerables enfermedades. Los presentes inventores han realizado extensas investigaciones clínicas y experimentos y han identificado moléculas de ARN pequeñas no codificantes que son capaces de suprimir la expresión del gen relacionado con la inflamación de las vías respiratorias in vitro o in vivo a través de la interferencia de ARN, por lo tanto, estas moléculas de ARN pequeñas identificadas son útiles como medicamento para el tratamiento de la alergia con el fin de aliviar o minimizar la inflamación de las vías respiratorias de un sujeto. Resumen El objeto de esta invención es proporcionar compuestos, composiciones y procedimientos para suprimir la expresión del gen relacionado con la inflamación de las vías respiratorias usando moléculas de ARN pequeñas de 35 interferencia (ARNsi). En particular, esta invención presenta moléculas de ácido ribonucleico pequeñas, tales como, moléculas de ARN pequeñas de interferencia de doble hebra o de una sola hebra; y procedimientos para suprimir la expresión de los genes relacionados con la inflamación de las vías respiratorias usando estas moléculas de ARNsi.   Por lo tanto, esta invención presenta una molécula de ARNsi de acuerdo con la reivindicación 1, un vector de expresión adecuado para expresar la molécula de ARNsi de acuerdo con la reivindicación 4 y un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8. La realizaciones preferidas son materia objeto de las reivindicaciones dependientes. En una realización, la invención proporciona una molécula de ARNsi de doble hebra aislada que dirige la escisión de ARN gata-3 a través de la interferencia de ARN (ARNi), en la que (a) cada hebra de dicha molécula de ARNsi es de aproximadamente 19 a 21 nucleótidos de longitud; y (b) una hebra de dicha molécula de ARNsi comprende una secuencia de ribonucleótidos complementaria a dicho ARN gata-3 para dirigir la escisión del ARN gata-3 a través de la interferencia de ARN. En una realización, la molécula de ARNsi aislada de esta invención es de origen humano, que comprende una secuencia de ribononucleótidos complementaria a una secuencia de ARN codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 a 45, en la que la SEQ ID NO: 32 representa las secuencias de ribonucleótidos del gen gata-3 en las posiciones 1080-1100. En una realización, la invención presenta una molécula de ARNsi aislada que tiene actividad ARNi contra una ARN gata-3. La molécula de ARNsi es capaz de mediar la interferencia de ARN (ARNi) que da como resultado la escisión del ARN gata-3 in vitro o in vivo. En otra realización, una molécula de ARNsi aislada de esta invención es de origen humano. La molécula de ARNsi humana de esta invención comprende una secuencia que es al menos idéntica al 80% al ARNsi17. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de la alergia, tal como polinosis, asma bronquial, sinusitis, síndrome de distrés respiratorio o rinitis alérgica mediante la supresión de la expresión del gen relacionado con la inflamación de las vías respiratorias, tal como la expresión del gen gata-3, usando 2 moléculas de ácido nucleico pequeñas de interferencia. En una realización, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARNsi de la invención en un transportador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la invención proporciona un vector de expresión de al menos una molécula de ARNsi de esta invención, que contiene una porción de un gen diana de interés, de manera que permite la expresión de las 5 moléculas de ARNsi para suprimir o contrarrestar la expresión del gen diana in vitro o in vivo a través de la interferencia de ARN (ARNi). El gen diana es un gen relacionado con la inflamación de las vías respiratorias, tal como el gen gata-3. Estos y otros aspectos y ventajas serán evidentes cuando la Descripción se lea junto con los Ejemplos adjuntos. Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplos, y 10 pretenden proporcionar una explicación adicional de la invención que se reivindica. Los ejemplos pueden comprender la materia objeto que no está incluida por las reivindicaciones adjuntas y se proporciona únicamente con files de ilustración. El alcance de la protección se define por las reivindicaciones adjuntas.   Breve descripción de los dibujos Los dibujos adjuntos se incluyen para proporcionar un entendimiento adicional de la invención, y se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva. Los dibujos ilustran realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. La fig. 1 son los dibujos esquemáticos de ARNsi gata-3 murinos en un plásmido pSEC hydro y un vector basado en lentivirus, en los que (A) es un diagrama esquemático del casete de expresión de ARNsi; (B) es un diagrama esquemático del plásmido pSEC hydro, que contiene un sitio de selección de hidromicina para seleccionar un clon estable que exprese los ARNsi; y (C) es un diagrama esquemático del vector de lentivirus que expresa ARNsi. La fig. 2 ilustra la reducción de la expresión del gen gata-3 y la liberación de citocinas Th2 después de la transducción de los ARNsi gata-3 en células EL-4 que se trataron con una combinación de PMA (5 ng/ml) y cAMP (500 mM) durante 24 h, la detección del gen gata-3 expresado y las proteínas se confirmó por (A) PCR en tiempo real y (B) transferencia de western, respectivamente; y (C) la liberación de citocinas Th2 se detectó mediante ensayo ELISA sándwich. En la figura, "Simulado" se refiere al control de transducción simulada contenido en el control de ARNsi negativo de Ambion; "PTYenlazador" se refiere a un vector vacío. a** p<0,01, en comparación con el grupo de control sin tratamiento previo; b** p<0,01, en comparación con el grupo de control de PMA 5 ng/ml + cAMP 500 mM; c** p<0,01, en comparación con el grupo simulado (Mock) de PMA 5 ng/ml + cAMP 500 mM; d** P<0,01, en comparación con el grupo PTYenlazador de PMA 5 ng/ml + cAMP 500 mM. La fig. 3 ilustra la línea cronológica del protocolo de OVA usado de acuerdo con una realización preferida de esta invención para establecer... [Seguir leyendo]

1. Un ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNsi) de doble hebra aislado que dirige la escisión de un ARN del gen gata-3 a través de la interferencia de ARN, en el que (a) cada hebra de dicha molécula de ARNsi es de aproximadamente 19 a 21 ribonucleótidos de longitud; y (b) una hebra de dicha molécula de ARNsi comprende una secuencia de ribonucleótidos complementaria a dicho ARN gata-3 codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 o una porción del mismo para dirigir la escisión del ARN gata-3 en la posición 1080-1100 a través de la interferencia de ARN. 2. La molécula de ARNsi de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ARNsi es de origen humano. 3. La molécula de ARNsi de la reivindicación 2, en la que dicha molécula de ARNsi es al menos idéntica al 80% al ARNsi 17 que tiene una secuencia de ácido ribonucleico de la SEQ ID NO: 47. 4. Un vector de expresión adecuado para expresar la molécula de ARNsi de la reivindicación 1 en un sujeto para el tratamiento de la alergia, que comprende un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 o una porción del mismo que codifica la molécula de ARNsi de la reivindicación 1. 5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que la alergia es polinosis, asma bronquial, sinusitis, síndrome de distrés respiratorio o rinitis alérgica. 6. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que dicha molécula de ARNsi es de origen humano. 7. El vector de expresión de la reivindicación 6, en el que dicha molécula de ARNsi es al menos idéntica al 80% al ARNsi 17 que tiene una secuencia de ácido ribonucleico de la SEQ ID NO: 47. 8. Un uso del ARNsi de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la alergia, en el que dicho ARNsi contrarresta la alergia mediante la supresión de la expresión del gen gata-3. 9. El uso de la reivindicación 8, en el que dicha molécula de ARNsi es de origen humano. 10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicha molécula de ARNsi es al menos idéntica al 80% al ARNsi 17 que tiene una secuencia de ácido ribonucleico de la SEQ ID NO: 47.   26   27   28   29     31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49