Vector del virus del herpes simple (HSV) que induce la expresión génica viral y la replicación viral específicamente en una célula que expresa calponina y que prolifera,

que no se replica en las células normales adultas, y que puede suprimir su replicación en un momento deseado utilizando el gen de la timidina cinasa, en el que el vector comprende un fragmento de ADN que comprende: (i) una región promotora del gen humano de la calponina, que comprende la secuencia nucleótida representada por SEC. ID. nº 3; (ii) el gen ICP4 que codifica un factor de transcripción esencial para la iniciación de una replicación del virus del herpes, que se integra corriente abajo de la región promotora del gen humano de la calponina; (iii) el gen EGFP (proteína verde fluorescente potenciada) unido corriente abajo del gen ICP4 mediante un sitio de entrada ribosómico interno; y (iv) el gen LacZ que se integra corriente arriba de dicha región promotora del gen humano de la calponina, y en el que este fragmento de ADN se inserta mediante recombinación en el locus del gen de la ribonucleótido reductasa de un vector HSV que comprende un gen de timidina cinasa endógeno y que carece de la función del gen ICP4 endógeno, y en el que la expresión de tanto el gen LacZ como del gen EGFP integrados en el vector, es utilizada como marcadores para identificar el vector HSV recombinante

CAMPO TÉCNICO

La presente descripción se refiere a un vector de expresión/replicación específico de células que puede expresar específicamente un gen en una célula específica, y que no actúa sobre las células adultas normales que se autorreplican; un vector celular de expresión/replicación específico para células que puede suprimir la expresión /replicación en un período deseado, después de su expresión/replicación; un procedimiento para expresar un gen en una célula específica en un organismo vivo utilizando el vector, o un procedimiento para alterar una célula específica utilizando el vector, etc. Para una descripción con mayor detalle, se hace referencia a: (1) la construcción, en el ámbito de la terapia génica para el cáncer, de un vector de expresión/replicación específico para células de alta seguridad, en la que un vector de expresión/replicación que puede expresar genes específicamente celulares para alterar específicamente una célula cancerosa particular, o una célula muscular lisa proliferante que se genera en el nuevo vaso sanguíneo tumoral, permita el tratamiento sin dañar las células normales y pueda eliminar completamente las células infectadas por el vector después de que la terapia haya finalizado, (2) la construcción de un vector de expresión/replicación específico para células de alta seguridad en el ámbito de la terapia génica contra la fibrosis, tal como la fibrosis pulmonar y la fibrosis hepática, en la que un vector de expresión/replicación que pueda expresar específicamente genes celulares para alterar de modo específico los miofibroblastos proliferantes que se generan, permita el tratamiento sin dañar las células normales y pueda eliminar completamente las células infectadas por el vector después de que la terapia haya concluido, (3) la construcción de un vector de expresión/replicación específico para células de alta seguridad, en el ámbito de la terapia génica, para afecciones tales como la vasoconstricción, arterioesclerosis, restenosis, retinopatía diabética y similares, después del emplazamiento de endoprótesis vasculares o del trasplante de órganos, en la que se genera un vector de expresión/replicación que puede expresar genes específicamente celulares para alterar de modo específico las células musculares lisas proliferantes, que permita el tratamiento sin afectar a las células normales y que pueda eliminar completamente las células infectadas por el vector, después de que la terapia haya finalizado, (4) la construcción de un vector de expresión/replicación específico para células de alta seguridad en el ámbito de la terapia génica para la glomerulonefritis, en la que se genera un vector de expresión/replicación que puede expresar genes específicamente celulares para alterar de modo específico las células mesangiales proliferantes, que permita el tratamiento sin afectar a las células normales y pueda eliminar completamente las células infectadas por el vector, después de que la terapia haya finalizado.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Recientemente, se deseado un procedimiento terapéutico ideal para el cáncer, con menos efectos secundarios, en el que las células normales no resulten afectadas y las cancerosas sólo puedan dañarse selectivamente. La terapia génica resulta ejemplificativa, pudiendo ésta aumentar la selectividad de las células cancerosas a varios niveles, tales como la actividad promotora de la expresión y de la selectividad celular de un gen que se introduzca en la célula cancerosa, o el procedimiento de inducción e infección por un vector viral, acaparando la atención como una prometedora terapia en el futuro. Sin embargo, existe un problema habitual, y es que el gen terapéutico no puede introducirse en todas las células cancerosas. Contrariamente a esto, en la inmunoterapia para el cáncer, ya que la expresión de un antígeno de diferenciación específico-tisular se observa ligeramente también en las células normales, han constituido un problema los efectos secundarios con respecto a las células normales. Además, ya que los antígenos cancerosos que se basan en una mutación presentan la característica de que ésta se limita a los cánceres individuales, no resulta apropiado generalizar con una inmunoterapia para el cáncer que esté dirigida molecularmente.

Recientemente, se ha llevado a cabo en los Estados Unidos y en Inglaterra un estudio clínico de terapia génica, con respecto a un tumor cerebral maligno, utilizando un virus del herpes simple competente para la replicación (HSV, vector) que, daña selectiva y continuamente sólo sobre las células proliferantes mediante la infección y la replicación (Gene Ther. 7, 859-866, 2000: Gene Ther. 7, 867-874, 2000). El vector HSV que se replica es un vector en el que la ribonucleótido reductasa (RR) o la timidina cinasa (TK), que son esenciales para la replicación vírica, están suprimidas. Estas enzimas se expresan en las células normales sólo cuando proliferan, pero se expresan constitutivamente en las células tumorales. Por tanto, cuando este vector HSV infecta a una célula que experimenta una proliferación intensa, sin considerar si es una célula normal o una célula tumoral, experimenta replicación con las RR o TK derivadas de las células, y muestra una actividad citolítica. Mientras, en el Japón, en un experimento con animales, se informó de un efecto antitumoral de los vectores HSV que experimentan replicación, contra el cáncer prostático y el cáncer pancreático

(J. Surg. Oncol. 72, 136-141, 1999). Sin embargo, éstos no presentan selectividad celular, siendo baja su seguridad. Por tanto, podría utilizarse en terapia humana en un cerebro en el que el vector no se difundiera a la sangre circulante, debido a la presencia de la barrera hematoencefálica, constituyendo un problema, sin embargo, que no fueran apropiados para el tratamiento en los órganos fuera del cerebro.

Tal como se ha expuesto anteriormente, se considera que será posible una nueva terapia más efectiva y segura, si puede controlarse la actividad "manipuladora" del vector HSV dirigiéndola específicamente a la célula diana. Martuza et al., de los Estados Unidos, informaron de un vector HSV competente en replicación, que es selectivo para tumores hepáticos, utilizando un promotor de albúmina (J. Virol. 71, 5124-5132, 1997). Sin embargo, cuando dicho vector se utiliza en el cáncer celular hepático, la expresión del gen de la albúmina disminuye, afectándose también las células hepáticas regenerativas normales y, por tanto, no se considera apropiado para la aplicación clínica en el hombre.

Sin embargo, la descripción de la patente US nº 5.728.379 (“Tumor- or cell-specific herpes simplex cirus replication”) considera la posibilidad de aplicación al mesotelioma. Sin embargo, no se considera la posibilidad de su aplicación a terapias para el sarcoma humano en general, tales como el liomiosarcoma, osteosarcoma, tumor estromático gastrointestinal (GIST), vaso tumoral, lesión vascular proliferante, glomerulonefritis proliferante, fibrosis pulmonar, hepática y similares, o miofibroblasto que prolifera en el estroma de los tumores malignos.

A partir de los análisis genéticos con respecto a la causa de la enfermedad y patología del sarcoma, se informa de la existencia de genes de fusión y de la mutación de p53 y Rb en algunos tumores, pero, sin embargo, no se ha alcanzado un nivel que pueda aplicarse ampliamente a las terapias. En un experimento animal que utiliza ratones desnudos, Milas et al, utilizó un vector adenovírico sin capacidad replicadora para introducir el gen p53 en las células de liomiosarcoma, e informó que existía un efecto de retraso en la proliferación de los tumores (Cancer Gene Ther. 7, 422-429, 2000). Existe también un informe con respecto a un procedimiento para introducir y expresar en el osteosarcoma, un gen suicida, la timidina cinasa, utilizando un promotor del gen de la osteocalcina (Cancer Gene Ther. 5, 274-280, 1998). Si embargo, utiliza un vector viral en el que se ha suprimido su utilidad replicadora, siendo escasa la eficiencia para la transferencia génica, y no pudiéndose, por tanto, aplicar a otro sarcoma distinto al osteosarcoma. Particularmente, según el informe de Milas et al., se proporciona un ejemplo que utiliza SK-LMS-1, una progenie celular humana de músculo liso, que es la misma progenie celular que la descrita en el informe (Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001). Sin embargo, se utiliza una cantidad con 100 a 1.000 veces más partículas virales en comparación con la cantidad de partículas del vector viral utilizada en el informe mencionado anteriormente, siendo la eficiencia menor que... [Seguir leyendo]

1. Vector del virus del herpes simple (HSV) que induce la expresión génica viral y la replicación viral específicamente en una célula que expresa calponina y que prolifera, que no se replica en las células normales adultas, y que puede suprimir su replicación en un momento deseado utilizando el gen de la timidina cinasa,

en el que el vector comprende un fragmento de ADN que comprende:

(i) una región promotora del gen humano de la calponina, que comprende la secuencia nucleótida representada por SEC. ID. nº 3;

(ii) el gen ICP4 que codifica un factor de transcripción esencial para la iniciación de una replicación del virus del herpes, que se integra corriente abajo de la región promotora del gen humano de la calponina;

(iii) el gen EGFP (proteína verde fluorescente potenciada) unido corriente abajo del gen ICP4 mediante un sitio de entrada ribosómico interno; y

(iv) el gen LacZ que se integra corriente arriba de dicha región promotora del gen humano de la calponina,

y en el que este fragmento de ADN se inserta mediante recombinación en el locus del gen de la ribonucleótido reductasa de un vector HSV que comprende un gen de timidina cinasa endógeno y que carece de la función del gen ICP4 endógeno,

y en el que la expresión de tanto el gen LacZ como del gen EGFP integrados en el vector, es utilizada como marcadores para identificar el vector HSV recombinante.

2. Vector HSV según la reivindicación 1, en el que un potenciador se integra corriente arriba de la región promotora del gen humano de la calponina.

3. Vector HSV según la reivindicación 2, en el que el potenciador es un potenciador 4F2.

4. Medicamento terapéutico que comprende el vector HSV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Procedimiento para producir un vector HSV, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, induciendo dicho vector una expresión génica viral y una replicación viral específicamente en una célula que expresa calponina y que prolifera, que no se replica en las células normales adultas, y que puede suprimir su replicación en un momento deseado utilizando el gen de la timidina cinasa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:

(a) preparar un fragmento de ADN que comprende:

(i) una región promotora del gen humano de la calponina, que comprende la secuencia nucleótida representada por SEC. ID. nº 3;

(ii) el gen ICP4 que codifica un factor de transcripción esencial para la iniciación de una replicación del virus del herpes, que se integra corriente abajo de la región promotora del gen humano de la calponina;

(iii) el gen EGFP unido corriente abajo del gen ICP4 mediante un sitio de etnrada ribosómico interno, y

(iv) el gen LacZ integrado corriente arriba de la región promotora del gen humano de la calponina,

(b) preparar recombinantes, mediante cotransfección con el vector HSV, que comprende un gen endógeno de la timidina cinasa y que carece de la función del gen endógeno lCP4, junto con el fragmento de ADN en una célula, en la que una región promotora del gen humano de la calponina que comprende la secuencia nucleótida representada por SEC. ID. nº 3, puede activarse, o una célula que exprese el gen humano de la calponina; y

(c) con el fin de cribar un vector HSV recombinante, en el que el fragmento de ADN se inserta mediante una recombinación homóloga en el locus del gen de la ribonucleótido reductasa del vector HSV que comprende un gen endógeno de la timidina cinasa y que carece de la función del gen endógeno ICP4 de entre los recombinantes, seleccionar un clon único del vector HSV de entre los recombinantes mediante dilución limitante, sin utilizar el ensayo de recubrimiento de agarosa utilizando las expresiones tanto del gen LacZ como del gen EGFP, como marcadores.