Una variante de una molécula de motor rotativo V1-ATPasa, resistente al calor que es capaz de continuar la actividad de ATP por al menos una hora después de la adición de ATP como sustrato,

la V1-ATPasa es una porción V1 de una V0V1-ATPasa obtenible de la bacteria termófila, Thermus thermophilus, y es una molécula compleja que tiene tres subunidades A, tres subunidades B y una subunidad D que constituyen la porción V1 de una V0V1-ATPasa, en donde, en la variante, las subunidades A tienen un resto Ala que sustituye al resto Ser en la posición 232 y un resto Ser que sustituye al resto Thr en la posición 235 en la secuencia de Nº de identificación 3

Molécula de motor rotativo V₁-ATPasa.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva molécula de motor rotativo V₁-ATPasa útil como un nano actuador de una micro máquina o una nano máquina, o similar.

Antecedentes de la invención

Se está prestando atención al desarrollo de una micro máquina o una nano máquina que se mueva mecánicamente según el tamaño de una molécula. Esto es debido a que dicha micro máquina o nano máquina se considera útil para, por ejemplo, un robot molecular que realiza el cableado de un ordenador molecular o un robot médico que opera una cura en el cuerpo humano.

Para la fabricación de una micro máquina y una nano máquina, se requiere el desarrollo de una variedad de tecnologías, que incluyen dispositivos de elementos individuales (un sensor, un actuador y una máquina miniatura) para procesarlos o ensamblarlos (micro maquinado y nano maquinado). En particular, el desarrollo de micro actuadores y nano actuadores (motores rotativos), por ejemplo, dispositivos de conducción de micro máquinas, es esencial para el movimiento auto regulado de las máquinas, y se está persiguiendo el desarrollo de dispositivos para motor que utilizan diversas tecnologías de manejo precisas. Sin embargo, incluso los micro actuadores fabricados mediante procedimientos que usan tecnologías de manejo precisas no son más pequeños de alrededor de 100 µm. Se requieren más miniaturizaciones de los instrumentos del motor para instalarlos en micro máquinas y nano máquinas.

De forma que, se propone además de la construcción de un motor mediante la tecnología de manipulación precisa, la utilización de una molécula única que tenga la capacidad de movimiento rotativo como un motor.

En general, una molécula capaz de actuar como un motor necesita satisfacer dos factores: que tenga un mecanismo de fuerza que convierta la energía exterior en un movimiento rotativo, y que la rotación lograda sea en una dirección. Los compuestos orgánicos de bajo peso molecular conocidos que satisfacen tales condiciones incluyen por ejemplo (3R,3'R)-(P,P)-trans-1,1',2,2',3,3',4,4'-octahidro-3,3'-dimetil-4,4'-bifenantridieno (Nature 401: 152-155, 1999) y Tripticil(4)heliceno (Nature 401: 150-152, 1999). El anterior tiene simetría a la derecha y a la izquierda del doble enlace carbono-carbono, pero tiene una estructura retorcida debido al bloqueo interno estérico. La adición del calor adecuado o la luz adecuada hace posible rotar la molécula en una dirección a través de cuatro etapas de proceso. Además, se completa un ciclo a través de dos reacciones de luz y una isomerización por calor, y el movimiento procede en solamente una dirección. En otras palabras, este compuesto orgánico conduce al movimiento rotativo vía la isomerización por calor y la reacción por la luz. La rotación vía la reacción por la luz es muy rápida (a nivel de picosegundos), pero la rotación vía isomerización por calor necesita unos pocos minutos, y por ello es inadecuada para el uso actual. Además, el compuesto tiene el problema de que la fuerza conductora de rotación es extremadamente débil. Por otro lado el calor de isomerización causa la rotación en una dirección de la molécula que utiliza las reacciones químicas de adición de fosgeno y la formación y rotura del enlace de uretano. Sin embargo, esta molécula es incapaz de repetir la rotación, un defecto fatal para un actuador.

Por otra parte, se conocen biomoléculas que como un motor de molécula única capaz de ser utilizado en una micro máquina, una nano máquina o similar, incluyen un motor de flagelo (Microbiol. 6: 1-18, 1967, Nature 245: 380-382, 1973), una ATP sintasa (Nature 386: 299-302, 1997), un motor de miosina (Biochem. Biophis. Res. Comm. 199: 1057-1063, 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 7: 89-93, 1995), un motor basado en el microtúbulo (Cell 42: 39-50, 1985), una proteína de motor de la sintasa del ácido nucleico (Nature 409. 113-119, 2001), y semejantes.

De estos, una ATP sintasa es una proteína de membrana presente por doquier, en localizaciones tales como las membranas internas de la mitocondria en eucariotas, membranas tilacoides de los cloroplastos, membranas de célula procariota, y semejantes, y sintetiza la mayoría del ATP consumido en las células. Una ATP sintasa (F₀F₁-ATP sintasa) es un complejo de proteína de membrana muy grande con peso molecular de hasta alrededor de 500.000, y consiste en una porción F₀ presente dentro de una membrana y una porción F₁ presente fuera de la membrana. La porción F₀ es un pasaje para un protón (H⁺) que pasa a través de la membrana, y la porción F₁ es una porción catalítica que sintetiza e hidroliza ATP. El peso molecular de la porción F₁ es de alrededor de 380.000, por ejemplo, la composición de la subunidad de la porción F₁ en una ATP sintasa derivada de las bacterias es a₃ ß₃ d ?₁ varepsilon₁. Las subunidades a y ß ambas tienen una porción de unión a ATP similar, pero la actividad catalítica está presente en la subunidad ß. Ambas alternativamente se alinean para formar un anillo y en el centro de este anillo a₃ ß₃, está presente una subunidad ?. Una subunidad d se une a la parte de arriba del anillo a₃ ß₃; una subunidad varepsilon que controla la actividad de hidrólisis de ATP se une a la subunidad ?. Por otra parte, la porción F₀ tiene un peso molecular de alrededor de 100.000, y la composición de aminoácidos contiene en cantidad ácido glutámico y ácido asparagínico, necesarios para el movimiento del protón. La composición de la subunidad es a₁b₂c_9-12, la subunidades "c" están arregladas como un anillo (el anillo "c") en la membrana, y al anillo "c" están unidas las subunidades "a" y dos subunidades "b" que tienen cada una un brazo que sale lejos fuera de la membrana. Por esto, una F₀F₁-ATP sintasa tiene una porción F₁ y una porción F₀ que están unidas una a otra en dos lugares: ? varepsilon-anillo "c" y d b_2. Una característica adicional es el hecho de que esta molécula de F₀F₁-ATP sintasa tiene dos clases de dispositivos que generan torsión. Uno es un dispositivo del tipo conductor de ATP presente en la porción F₁ y el otro es un dispositivo del tipo conductor de protón presente en la porción F₀. Esto es, cuando la porción F₀ toma un protón en la membrana celular, el anillo "c" rota en el sentido de las agujas del reloj; cuando la porción F₀ descarga un protón al exterior de la membrana celular, el anillo "c" rota en el sentido contrario a las agujas del reloj. Por otra parte, durante la síntesis de ATP, la porción F₁ rota en el sentido de las agujas del reloj viendo la subunidad ? desde el lado F₀, y la porción F₁ rota en el sentido contrario a las agujas del reloj durante la descomposición del ATP. Mediante la provisión de estas dos clases de dispositivos generadores de torsión, la torsión generada por la ATP sintasa está en el orden de decenas de piconewtons x nm, y de esta forma la sintasa tiene una fuerza conductora suficiente para un motor molecular. Adicionalmente, una ATP sintasa actúa en un sistema acuoso y es así lo más adecuado como actuador que trabaje en el cuerpo humano, y también puede manipular una proteína, azúcar, lípido, o ácido nucleico en el cuerpo ya que tiene suficiente poder para mover la actina.

Los inventores de la presente invención mejoraron esta molécula de F₀F₁-ATP sintasa, y tienen ya inventada y solicitada la invención de una molécula de F₀F₁-ATP sintasa modificada capaz de controlar la moción en un amplio intervalo de velocidad de rotación y su utilización (Solicitud de patente japonesa Nº. 2002-148232; fecha de solicitud: 22 de Mayo de 2002). Además, recientemente, se describió una molécula de motor rotativo, que está hecha por la incorporación de un lugar de unión de zinc en una molécula de F₁-ATP sintasa y que es capaz de controlar la iniciación y parada de la rotación por medio del zinc (Nature Materials 1: 173-177, 2002).

Como se describió anteriormente, varias moléculas de motor rotativo se proponen como miembros conductores de una micro máquina, una nano máquina, y semejantes, y las moléculas cada una tiene características en cuanto al tipo de rotación, el número de revoluciones, la torsión, el método de controlar...

1. Una variante de una molécula de motor rotativo V₁-ATPasa, resistente al calor que es capaz de continuar la actividad de ATP por al menos una hora después de la adición de ATP como sustrato, la V₁-ATPasa es una porción V₁ de una V₀V₁-ATPasa obtenible de la bacteria termófila, Thermus thermophilus, y es una molécula compleja que tiene tres subunidades A, tres subunidades B y una subunidad D que constituyen la porción V₁ de una V₀V₁-ATPasa, en donde, en la variante, las subunidades A tienen un resto Ala que sustituye al resto Ser en la posición 232 y un resto Ser que sustituye al resto Thr en la posición 235 en la secuencia de Nº de identificación 3.

2. La molécula de motor rotativo V₁-ATPasa de la reivindicación 1, en donde al menos una de las subunidades A y las subunidades B de la misma, están fijas sobre un sustrato.

3. La molécula de motor rotativo V₁-ATPasa de la reivindicación 2, que está fija sobre el sustrato por medio de una etiqueta His unida al N terminal de la subunidad A.

4. La molécula de motor rotativo V₁-ATPasa de la reivindicaciones 1, 2 o 3, a la que se une una subunidad D con un material de junta.

5. La molécula de motor rotativo V₁-ATPasa de la reivindicación 4, en donde la junta está unida a al menos un resto Cys que sustituye al resto Glu en la posición 48 y un resto Cys que sustituye al resto Gln en la posición 55 en la secuencia de Nº de identificación 5.

6. La molécula de motor rotativo V₁-ATPasa de la reivindicación 5, en donde todos los restos Cys en la subunidad A y en la subunidad B están reemplazados por restos que no son Cys.