Un método para producir L-arginina, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo que contiene un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido argD2,

en donde el polipéptido argD2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 1

Campo técnico

La presente invención se refiere a una cepa mutante productora de L-arginina, que produce L-arginina con un alto rendimiento para ser usada en las industrias medicinales y farmacéuticas, y a un método para fabricar la misma. En particular, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto gen de la acetilornitina-aminotransferasa implicada en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum, un polipéptido codificado por el polinucleótido, un vector recombinante que comprende el polinucleótido, un transformante capaz de producir L-arginina con alto rendimiento, que se prepara introduciendo el vector recombinante en un microorganismo hospedante productor de L-arginina para sobre-expresar el gen argD2 y a un método para producir L-arginina cultivando el transformante.

Fundamento técnico

La L-arginina es un aminoácido que en su forma libre se encuentra en semillas de plantas o en el ajo. La L-arginina ha sido ampliamente usada como un aditivo eficiente en medicamentos, alimentos o similares. La L-arginina es útil como fármaco para mejorar la función hepática y la función cerebral y para tratar la esterilidad masculina, y como un ingrediente de de suplementos de múltiples aminoácidos. Además, la L-arginina se ha usado como aditivo alimenticio en croquetas de pescado y bebidas dietéticas, y recientemente ha ganado interés como sustituto de la sal común para pacientes hipertensos.

Los métodos convencionales para la producción de L-arginina por fermentación biológica se basan en la producción de L-arginina directamente a partir de fuentes carbonadas y nitrogenadas. Por ejemplo, la L-arginina puede ser producida usando una cepa mutante derivada de un microorganismo productor de ácido glutámico que pertenece al género Brevibacterium o Corynebacterium (Publicaciones de patentes japonesas no examinadas Nº Sho57-163487, Sho60-83593 y Sho62-265988) o usando un microorganismo productor del aminoácido, cuyas propiedades de crecimiento son mejoradas mediante la fusión celular (Publicación de patente japonesa no publicada Nº Sho59158185). Recientemente se ha descrito que la L-arginina se puede producir usando una cepa recombinante, en la cual está inactivado su gen argR que participa en la regulación de la biosíntesis de arginina (Solicitud de patente de EE.UU. Nº 2002/0045223A1) y usando un método para sobre-expresar un gen argF del operón de arginina (Solicitud de patente coreana Nº 10-2004-107215).

En los microorganismos, la biosíntesis de L-arginina transcurre en ocho etapas enzimáticas que parten del precursor L-glutamato y sigue dos vías diferentes, la vía lineal y la vía cíclica.

En microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium, la L-arginina se sintetiza a través de la vía cíclica a partir de L-glutamato vía N-acetilglutamato, fosfato de N-acetilglutamilo, N-acetilglutamato-semialdehído, Nacetilornitina, ornitina, citrulina y argininosuccinato. Estos productos intermedios se sintetizan a través de reacciones consecutivas catalizadas por enzimas tales como glutamato N-acetiltransferasa, N-acetilglutamato-quinasa, acetilglutamato-semialdehído-deshidrogenasa, acetilornitina-aminotransferasa, ornitina-carbamoiltransferasa, argininosuccinato-sintasa y argininosuccinato-liasa. Estas enzimas están codificadas por los genes argJ, argB, argC, argD, argF, argG y argH, respectivamente.

Para producir L-arginina con alto rendimiento, las autores de la presente invención han realizado estudios sobre las enzimas implicadas en la biosíntesis de L-arginina durante un largo periodo de tiempo. Encontraron que en la etapa intermedia de la biosíntesis de arginina, se amplifica la reacción enzimática implicaba la conversión de Nacetilglutamato-semialdehído en N-acetilornitina para aumentar el flujo de L-arginina, mejorando de este modo la productividad de L-arginina.

En las células está presente una variedad de aminotransferasas, y se dividen en cuatro subgrupos sobre la base de su relación estructural mutua. El subgrupo I comprende aspartilornitina, alanina, tirosina, histidiolfosfato y fenilalanina

45 -aminotransferasas, el subgrupo II comprende acetilornitina, ornitina, ω-aminoácido, aminobutirato y fenilalaninaaminotransferasas, el subgrupo III comprende D-alanina y aminoácido de cadena ramificada-aminotransferasas, y el subgrupo IV comprende serina y fosfoserina-aminotransferasas (Perdeep K. MEHTA, et al., Eur. J. Biochem., 214, 549-561, 1993).

Se sabe que en Corynebacterium glutamicum, existe un gen argCJBDF implicado en la biosíntesis de arginina en forma de un operón, y está regulado por inhibición por retroalimentación debida a arginina (Vehary Sakanyan, et al., Microbiology, 142:9-108, 1996). Por tanto, hay un límite en producir L-arginina con alto rendimiento.

Descripción de la invención

Problema técnico

Por consiguiente, los autores de la presente invención se han esforzado en desarrollar estas cepas capaces de producir L-arginina con alto rendimiento. Encontraron que un microorganismo transformado con un gen argD2, que es un supuesto gen que tiene la misma función que un gen argD que codifica acetilornitina-aminotransferasas, sobre-expresa el gen argD2 y produce L-arginina con mayor rendimiento que una cepa parental, completando de este modo la presente invención.

Solución técnica

Es un objeto de la presente invención proporcionar un polipéptido codificado por ungen argD2 (NcgI2355) que es un supuesto gen de acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar a vector recombinante que comprende a secuencia de bases que codifica el polipéptido.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un transformante capaz de producir L-arginina con alto rendimiento, que se prepara introduciendo el vector recombinante.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un método para producir L-arginina cultivando el transformante. Sin embargo, en particular, la presente invención se refiere a un método de producir L-arginina según se reivindica más adelante. Las realizaciones preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la construcción de un plásmido recombinante pHC131T-argD2, que comprende un gen argD2, el promotor CJ1 y el terminador rrnB1B2.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

En una realización la presente invención proporciona un polipéptido codificado por un gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto gen de acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum. Preferiblemente la secuencia de aminoácidos del polipéptido puede estar representada por la SEQ ID NO. 1.

El gen argD2 (Ncgl2355) que es un supuesto gen de la acetilornitina-aminotransferasa implicado en la biosíntesis de arginina por Corynebacterium glutamicum es una aminotransferasa clasificada en el subgrupo II de acuerdo con el análisis basado en el genoma (Alice C. McHardy, et al., J. Biotechnology, 104, 229-240, 2003). Sin embargo, la función de la proteína codificada por el gen argD2 no ha sido claramente identificada. Hay poca homología de secuencia entre los genes argD y argD2, sin embargo, ambos genes tienen el mismo resto, subgrupo II de aminotransferasa. Por tanto se deduce, que proteína codificada por el gen argD2 tiene una función similar a la acetilornitina-aminotransferasa que es codificada por el gen argD y requerida para la biosíntesis de arginina (www.genome,jp/kegg/).

Puede verse que la cepa que produce L-arginina transformada con un vector recombinante que comprende el gen argD2 produce L-arginina con un rendimiento superior al de la cepa parental.

También se proporciona polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Preferiblemente, la secuencia de bases del polinucleótido puede estar representada por la SEQ ID NO. 2. Además, se describe también un polinucleótido que tiene 70% o más de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO. 2, preferiblemente 90% o más de homología con la secuencia de bases de SEQ ID NO. 2. También se describe un vector recombinante que comprende el polinucleótido. Preferiblemente, el vector recombinante puede comprender el polinucleótido representado... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir L-arginina, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo que contiene un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido argD2, en donde el polipéptido argD2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 1.

2. El método para producir L-arginina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucleótido consiste en la SEQ ID NO.2.

3. El método para producir L-arginina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo pertenece al género Corynebacterium.

4. El método para producir L-arginina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo se identifica por el número de acceso KCCM10820P o KCCM10821P.