Una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde el residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido con Val o Ile,

en donde un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente 1.25 cuando es probado en un ensayo de hidrólisis in vitro, en el que el Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de microtitulación, usando 1 mM de D-Ile-pro-Arg-P-nitroanilina, Factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, a un pH de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl2 y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y en el que la absorbencia a 405 nm es usada para calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del Factor VII y factor VIIa de tipo salvaje

Variantes del factor de coagulación VII humano.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas variantes del factor de coagulación VIIa humano que tienen actividad coagulante al igual que constructos de ácido nucleico que codifican tales variantes, vectores y células huéspedes que comprenden y expresan el ácido nucleico, composiciones farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.

Antecedentes de la invención

La coagulación sanguínea es un proceso que consiste en una compleja interacción de varios componentes sanguíneos (o factores) que eventualmente da lugar a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan en lo que se hace referencia como la "cascada" de la coagulación, son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que en sí es un factor de coagulación activado). A los factores de coagulación que han sido objeto de tal conversión se hace referencia generalmente como "factores activos", y son designados por la adición de la letra "a" al nombre del factor de coagulación (p. ej. factor VIIa).

La iniciación del proceso hemostático es mediada por la formación de un complejo entre el factor tisular, expuesto como resultado de una lesión a la pared del vaso, y el factor VIIa. Este complejo convierte entonces a los factores IX y X a sus formas activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina a trombina en la célula que porta el factor tisular. La trombina activa las plaquetas y factores V y VIII en Factores Va y VIIIa, ambos cofactores en el proceso adicional que conduce al completo estallido de la trombina. Este proceso incluye la generación de Factor Xa por el factor IXa (en complejo con el factor VIIIa) y ocurre en la superficie de las plaquetas activadas. La trombina convierte finalmente el fibrinógeno en fibrina resultando en la formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años se ha descubierto que el factor VII y factor tisular son los principales iniciadores de la coagulación sanguínea.

El factor VII es una glicoproteína de trazas de plasma que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno es catalíticamente inactivo. El factor VII monocatenario puede ser convertido en factor VIIa bicatenario por el Factor Xa, factor XIIa, factor IXa, factor VIIa o trombina in vitro. El factor Xa se cree que es el activador fisiológico más importante del factor VII. Como varias otras proteínas plasmáticas implicadas en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K para su actividad, que se requiere para la gamma-carboxilación de los múltiples residuos de ácido glutámico que están agrupados cerca del amino terminal de la proteína. Estos ácidos glutámicos gamma-carboxilados se requieren para la interacción metálica inducida por ión del factor VII con los fosfolípidos. La conversión del factor VII zimógeno en la molécula bicatenaria activada ocurre por la escisión de un enlace peptídico Arg₁₅₂-Ile₁₅₃ interno. En presencia del factor tisular, fosfolípidos e iones de calcio, el factor VIIa bicatenario activa rápidamente el factor X o factor IX por la proteólisis limitada.

A menudo es deseable estimular o mejorar la cascada de coagulación en un sujeto. El factor VIIa ha sido usado para controlar los trastornos sanguíneos que tienen varias causas tal como las deficiencias del factor de la coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de los factores de coagulación XI o VII) o inhibidores del factor de la coagulación. El factor VIIa también ha sido usado para controlar el sangrado excesivo que ocurre en sujetos con una cascada de coagulación sanguínea que funciona normalmente (ninguna deficiencia del factor de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de la coagulación). Tal sangrado puede, por ejemplo, ser causado por una función defectuosa de las plaquetas, trombocitopenia o la enfermedad de Von Willebrand. El sangrado también es un problema importante en relación con la cirugía y otras formas de daño tisular.

La Patente europea nº. 200,421 (ZymoGenetics) se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor VII humano y la expresión recombinante del factor VII en células mamíferas.

Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una variante del Factor VII en donde Leu305 ha sido sustituido por Ala (FVII(Ala305)).

Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (suplemento de Agosto de 1999), 466, resumen 1474) se refiere a las variantes del factor VIIa en donde los residuos 316-320 son eliminados o los residuos 311-322 son sustituidos con los correspondientes residuos de tripsina.

No obstante, sigue habiendo la necesidad de variantes del factor VIIa que tienen actividad coagulante, variantes con actividad alta que pueden ser administradas en dosis relativamente bajas, y variantes que no producen los efectos secundarios indeseables tal como la activación sistémica del sistema de coagulación y sangrado, respectivamente, asociado a las terapias convencionales.

La invención proporciona variantes del factor de coagulación VII(a) con actividad coagulante. En un primer aspecto, la invención proporciona una variante del factor VII(a) de coagulación humano en donde: el residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 ha sido sustituida por Val o Ile, un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones del dominio de la proteasa han sido sustituidos, y la proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo del factor VII(a) es al menos aproximadamente 1.25 cuando es evaluado en el ensayo de hidrólisis in vitro definido aquí. Dicha variante del factor VII(a) humano puede ser codificada por constructos de ácido nucleico.

Resumen de la invención

En una forma de realización, el residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 y como mucho 20 residuos del aminoácido en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa (posiciones 153-406) han sido sustituidas. En una forma de realización, como mucho 15 residuos de aminoácidos adicionales son sustituidos; en otra forma de realización, como mucho 10 residuos de aminoácidos son sustituidos; en otra forma de realización, como mucho 5 residuos de aminoácidos son sustituidos.

En otra forma de realización de la invención el residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos un residuo en la posición 274 y/o 300-304 y/o la posición 306-312 han sido sustituidos.

En otra forma de realización, el residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos el residuo en la posición 274 han sido sustituidos.

En otra forma de realización, el residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos un residuo en la posición 300-304 han sido sustituidos.

En otra forma de realización, el residuo Leu en la posición 305 de la SEC ID nº 1 y al menos un residuo en la posición 306-312 han sido sustituidos.

En otra forma de realización, el residuo Ala en la posición 274 ha sido sustituido por Met o Leu o Lys o Arg; y/o el residuo Arg en la posición 304 ha sido sustituido por Tyr o Phe o Leu o Met; y/o el residuo Met en la posición 306 ha sido sustituido por Asp o Asn; y/o el residuo Asp en la posición 309 ha sido sustituido por Ser o Thr.

En otra forma de realización, el residuo Leu en la posición 305 es el único residuo de aminoácido que ha sido sustituido.

En una forma de realización específica, el residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido por Val.

En otra forma de realización, el residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido por un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Val, y Ile.

En una forma de realización de la invención los residuos 300-322, 305-322, 300-312, o 305-312 de la SEC ID nº 1 son sustituidos por las correspondientes secuencias de tripsina (SEC ID Nos 3,7,11,15, respectivamente), trombina (SEC ID Nos 4,8,12,16, respectivamente), Factor Xa (SEC ID nº 5,9,13,17, respectivamente) u otra serina proteasa constitutivamente activa. En otra forma de realización más, uno o más de los residuos 313-322 de la SEC ID nº 1 es/son borrado(s).

La presente invención también proporciona una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde la proporción entre la...

1. Una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde el residuo Leu en la posición 305 ha sido sustituido con Val o Ile, en donde un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente 1.25 cuando es probado en un ensayo de hidrólisis in vitro, en el que el Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de microtitulación, usando 1 mM de D-Ile-pro-Arg-P-nitroanilina, Factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, a un pH de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl₂ y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y en el que la absorbencia a 405 nm es usada para calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del Factor VII y factor VIIa de tipo salvaje.

2. La variante del factor de coagulación VII humano según la reivindicaciones 1, en donde al menos un residuo, en la(s) posición(es) 274 y/o 300-304 y/o 306-312, ha sido sustituido.

3. La variante del factor de coagulación humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde al menos el residuo en la posición 274 ha sido sustituido.

4. La variante del factor de coagulación VII humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde al menos un residuo en la(s) posición(es) 300-304 ha sido sustituido.

5. La variante del factor de coagulación VII humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde al menos un residuo en la(s) posición(es) 306-312 ha sido sustituido.

6. La variante del factor de coagulación VII humano según la reivindicación 3, en donde el residuo Ala en la posición 274 ha sido sustituido por Met o Leu o Lys o Arg; y/o el residuo Arg en la posición 304 ha sido sustituido por Tyr o Phe o Leu o Met; y/o el residuo Met en la posición 306 ha sido sustituido por Asp o Asn; y/o el residuo Asp en la posición 309 ha sido sustituido por Ser o Thr.

7. La variante del factor de coagulación VII humano según la reivindicación 1, en donde el residuo Leu en la posición 305 es el único residuo que ha sido sustituido.

8. Un constructo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del Factor VII que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector recombinante que comprende el constructo de ácido nucleico que se define en la reivindicación 8.

10. Una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácido nucleico que se define en la reivindicación 8 o el vector que se define en la reivindicación 9.

11. Un método para producir la variante del factor de coagulación VII humano que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el método que comprende cultivar una célula, como se define en la reivindicación 10, en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones que permiten la expresión del constructo de ácido nucleico, y recuperar el resultante polipéptido del medio de cultivo.

12. Una composición farmacéutica que comprende una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde la Leu en la posición 305 ha sido sustituida por Val o Ile, en donde un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente 1.25 cuando es probaba en un ensayo de hidrólisis in vitro, en el que el factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de microtitulación, usando 1 mM de D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina, factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, un pH de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl₂ y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y en el cual la absorbencia a 405 nm es usada para calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del factor VII y factor VIIa de tipo salvaje; y, opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición farmacéutica que comprende una variante del Factor de coagulación VII humano, en donde la Leu en la posición 305 ha sido sustituida por Val o Ile, en donde un máximo de 20 residuos de aminoácidos en las restantes posiciones en el dominio de la proteasa han sido sustituidos y en donde la proporción entre la actividad de dicha variante y la actividad del polipéptido nativo del factor VII es de al menos aproximadamente 1.25, cuando es probado en el ensayo de hidrólisis in vitro, en el que el factor VIIa nativo (tipo salvaje) y dicha variante del factor VIIa son evaluados en paralelo, en una placa de microtitulación, usando 1 mM de D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina, factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, un pH de 7.4, 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl₂ y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y en el cual la absorbencia a 405 nm es usada para calcular la proporción entre las actividades de dicha variante del Factor VII y Factor VIIa de tipo salvaje, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios de sangrado o para la intensificación del sistema hemostático normal.