UN ANTICUERPO MONOCLONAL ESPECIFICO FRENTE AL ANTIGENO H:1,2 DE SALMONELLA ENTERICA SEROTIPO TYPHIMURIUM QUE PRESENTA REACTIVIDAD CRUZADA CON SALMONELLA ENTERICA SEROTIPO 4,5,12:I:-, LINEA CELULAR PRODUCTORA, Y SU USO.

Un anticuerpo monoclonal específico frente al antígeno H:1,2 Salmonella enterica serotipo Typhimurium que presenta reactividad cruzada con Salmonella enterica serotipo 4,5,12;i:-, línea celular productora, y su uso. Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer específicamente antígenos asociados a flagelos de Salmonella, a la obtención de una línea celular murina productora y a su aplicación mediante técnicas inmunológicas para la detección de dicho microorganismo. Estado de la técnica El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae y se encuentra englobado entre los bacilos Gram negativos anaerobios facultativos, cuyas características tanto biológicas como bioquímicas se describen en el Manual Bergeys. Se trata de uno de los agentes patógenos más ubicuos en la naturaleza, pudiendo encontrarse tanto en humanos, animales y alimentos, como en muestras ambientales. Este género constituye uno de los patógenos más importantes para el ser humano y los animales. Las enfermedades que produce, también denominadas salmonelosis, están relacionadas principalmente con la ingesta de alimentos o aguas contaminadas, aunque en ocasiones se han descrito casos asociados con la transmisión persona-persona. Es necesario destacar la importancia de los portadores asintomáticos como transmisores de dicha infección. Se conocen dos especies denominadas Salmonella enterica y S. bongori que se diferencian por características bioquímicas y la primera se subdivide a su vez en varias subespecies. Dentro de estas especies la discriminación entre cepas y clones se basa principalmente en características de tres tipos de antígenos según el esquema de Kauffmann- White de serotipificación del género Salmonella. Estos tres tipos de antígenos son: antígeno somático (O), flagelar de primera fase (H1) y flagelar de segunda fase (H2). Los antígenos H (o flagelares) se encuentran en las subunidades proteicas de flagelina que conforman la estructura flagelar. En ocasiones también se identifica un cuarto antígeno capsular denominado Vi. En algunos casos, a bacterias pertenecientes a un serotipo o fórmula antigénica se le asigna un nombre común. A modo de ejemplo, la fórmula antigénica 4,5,12:i:1,2 corresponde al serotipo Typhimurium. Las cepas de Salmonella tienen la particularidad de poseer 2 tipos de flagelos, de primera y de segunda fase, que no se producen nunca a la vez en la misma célula. Una única bacteria de este género producirá uno de esos tipos de antígenos flagelares y tras sucesivas divisiones, alguna de las células hijas comenzará a producir flagelos del otro tipo. Por ello sólo se detecta uno de los dos tipos cuando se realiza la serotipificación y para identificar el otro se debe provocar un cambio de fase. Los flagelos son polímeros de unas proteínas filamentosas denominadas flagelinas en las que reside la especificidad antigénica. La mayor parte de las bacterias del género Salmonella pueden expresar dos formas antigénicas de estas proteínas flagelares a las que se denominan fase 1 y fase 2. El antígeno flagelar puede presentarse alternativamente en fase 1 si se expresa el gen fliC, o en fase 2 si se expresa por el contrario el gen fljB. El fenómeno de cambio entre una fase y otra se denomina variación de fase y está regulado por fenómenos genéticos de inversión de las secuencias de los genes, actuando como interruptores que activan unos genes y desactivan los otros. Este fenómeno de variación de fase está muy bien estudiado en Salmonella, siendo regulado por factores ambientales y de presión inmunológica. Puesto que existen más de 2.500 serotipos de Salmonella y solo algunos de ellos se suelen relacionar con patologías humanas, es muy útil obtener información sobre el tipo de Salmonella presente en una muestra. El serotipo de Salmonella, además del fagotipo o la información sobre su susceptibilidad anti microbiana son muy útiles para estimar el origen de la infección, para establecer relaciones entre diferentes muestras implicadas en el mismo brote o para predecir la gravedad de ciertas infecciones. Cuatro son los serotipos predominantes de la especie Salmonella enterica aislados en España con mayor frecuencia: ser. Enteritidis, ser. Typhimurium, ser. Hadar y subsp. I ser. 4,5,12:i:-. Dentro del serotipo Typhimurium se encuentra el fagotipo DT104 que generalmente es multirresistente a agentes antimicrobianos y muestra un patrón de resistencia ACSSUT (ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamida y tetraciclina). Por otra parte, el serotipo monofásico Salmonella enterica subsp. I serotipo 4,5,12:i:- pertenece al fagotipo U302 de Salmonella enterica ser. Typhimurium, ha perdido aparentemente su operón genético de cambio de fase y el gen fljB y se está extendiendo rápidamente en España y a nivel mundial. Este serotipo también es resistente a los antimicrobianos. En 1975, Kohler y Milstein descubrieron que ciertas líneas de células de ratón podían ser fusionadas con células de bazo de este animal para crear hibridomas, cada uno de ellos capaz de segregar anticuerpos de una especificidad única, es decir, anticuerpos monoclonales. Con la introducción de esta tecnología, resultó posible en algunos casos producir grandes cantidades de anticuerpos murinos específicos contra un determinante o determinantes particulares situados en antígenos. Es de gran interés proporcionar métodos de ensayo por medio de los cuales se puedan detectar organismos del género Salmonella. En los últimos años, se han ideado ensayos inmunológicos en los que se generan anticuerpos monoclonales contra antígenos y que, por aprovechamiento de la unión específica entre ellos, sirven para poder detectar la presencia de dicho antígeno. Estas pruebas inmunoenzimáticas que utilizan anticuerpos monoclonales son fáciles 2 ES 2 349 204 A1 de realizar, rápidas y tienen un precio de coste asequible. Su mayor inconveniente puede residir en el hecho de que con cierta frecuencia dan falsas reacciones positivas y a veces falsas reacciones negativas. Se sabe que Salmonella presenta estructuras sobre su superficie, como los flagelos, y que estos pueden ser antigénicamente distintos, es decir, que muestran epítopos específicos diferentes en los antígenos flagelares. Existen métodos para generar anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie de microorganismos que luego pueden ser aplicados en ensayos inmunológicos para su detección. Existen documentos en la bibliografía del estado de la técnica (De Vries N. y cois, Applied and Environmental Microbiology 64: 5033-5038 (1998); Sojka M. y cols., Veterinary Microbiology 78: 61-77 (2001)) en los que se describe la producción de anticuerpos monoclonales frente a antígenos flagelares de primera fase H:i y de segunda fase H:1,2. Debemos reseñar que dentro del grupo de cepas de Salmonella que se utilizan para demostrar la especificidad de los mismos no aparecen representantes para todos los antígenos flagelares pertenecientes al complejo de segunda fase H1 (H:1,2; H:1,5; H:1,6 y H:1,7), los cuales presentan una elevada similitud entre sí, así como el bajo número de cepas examinadas. Por otra parte, destacar también el pequeño número de serotipos testados que presentan H:i como antígeno flagelar de primera fase. Debido a ello desconocemos si estos anticuerpos monoclonales presentan reactividad cruzada al ser enfrentados a los antígenos similares o no. Nuestra invención proporciona una nueva línea celular que produce un anticuerpo monoclonal específico frente a Salmonella enterica ser. Typhimurium y de forma cruzada frente a Salmonella enterica ser. 4,5,12:i:-, que no presenta reactividad cruzada cuando es enfrentado a antígenos flagelares pertenecientes al complejo antigénico H1 de segunda fase (H:1,2; H:1,5; H:1,6 y H:1,7). Tampoco presenta reactividad cruzada cuando es enfrentado a antígenos flagelares H:i de primera fase, ni a los antígenos flagelares de primera y de segunda fase de los serotipos de Salmonella enterica aislados más frecuentemente. Por último, tampoco se observa reactividad cruzada cuando es enfrentado a un grupo de microorganismos pertenecientes a otras especies. Existen diferentes casas comerciales que distribuyen diferentes anticuerpos monoclonales frente a antígenos flagelares de Salmonella, mostrando la mayoría de ellos reactividad cruzada entre distintos serotipos y por tanto impidiendo la caracterización concreta del microorganismo. Otras casas comerciales no presentan datos de reactividad cruzada entre los distintos serotipos. Dentro de las casas comerciales que desarrollan esta serie de reactivos encontramos: Biodesign Internacional, Innotek, Novus Biologicals, Maine Biotechnology Services, Serotec, USBiological o Sifin. Por otra parte, dentro de los anticuerpos monoclonales frente a Salmonella enterica...

1. Un procedimiento para la obtención de un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) inmunizar un animal con el antígeno flagelar H:1,2 aislado; b) inmortalizar los linfocitos B procedentes de los ratones inmunizados en el paso anterior, mediante su fusión con células de mieloma para dar lugar a un hibridoma; c) aislamiento de aquellos clones de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales reactivos frente al antígeno flagelar H:1,2; d) cultivo de dichos clones celulares y posterior obtención del anticuerpo monoclonal de interés, fragmento o variante del mismo, caracterizado porque dicho anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo reacciona específicamente frente al antígeno flagelar H:1,2 presente en Salmonella enterica serotipo Typhimurium y de forma cruzada con el serotipo 4,5,12:i:-. 2. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo obtenido según el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado porque reacciona específicamente frente al antígeno flagelar H:1,2 presente en Salmonella enterica serotipo Typhimurium y de forma cruzada con el serotipo 4,5,12:i:-. 3. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo según la reivindicación 2, caracterizado porque el animal inmunizado para su obtención está seleccionado entre: conejo, cabra y ratón. 4. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho anticuerpo posee un isotipo seleccionado entre: IgG, e IgM. 5. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el hibridoma aislado en el paso c) de su procedimiento de obtención es la línea celular 23D4, ECACC no. 05122301. 6. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho anticuerpo es murino. 7. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo según una de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque dicho anticuerpo es del isotipo IgM. 8. Un anticuerpo monoclonal, fragmento o variante del mismo según una de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque dicho anticuerpo monoclonal se encuentra en sobrenadante, ascites o purificado. 9. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 caracterizado porque está seleccionado entre: un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2 y un fragmento Fv. 10. Una línea celular capaz de producir un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente frente al antígeno H:1,2 presente en el serotipo Typhimurium y de forma cruzada con el serotipo 4,5,12:i:- de Salmonella enterica definido en las reivindicaciones 2 a 8 caracterizada porque dicha línea celular es la línea 23D4, ECACC no. 05122301. 11. Uso de un anticuerpo, fragmento o variante del mismo según una de las reivindicaciones 2 a 9, para detectar la presencia de los serotipos Typhimurium o 4,5,12:i:- de Salmonella enterica en una muestra. 12. Uso de un anticuerpo, fragmento o variante del mismo según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha muestra está seleccionada entre una muestra alimentaria y una muestra clínica. 13. Uso de un anticuerpo, fragmento o variante del mismo según una de las reivindicaciones 11 u 12, caracterizado porque dicha muestra clínica está seleccionada entre sangre, suero, plasma y orina. 14. Uso de un anticuerpo monoclonal, un fragmento o variante del mismo según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque dicha detección se realiza mediante un ensayo seleccionado entre: ELISA, Western-blot y Dot-blot. 9 ES 2 349 204 A1 ES 2 349 204 A1 11 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA