SISTEMA DE REGULACIÓN DE MÚLTIPLES GENES INDUCIBLES.

Sistema de regulación de múltiples genes inducibles, que comprende una pluralidad de sistemas de regulación génica individualmente operables,

en el que: a) cada sistema de regulación génica individualmente operable comprende: en el que: i) uno o más polinucleótidos codificantes de un complejo de receptores que comprende: A) un dominio de unión a ADN, B) un primer dominio de unión a ligando de receptor nuclear y un segundo dominio de unión a ligando de receptor nuclear, y C) un dominio de transactivación, ii) un ligando, iii) un polinucleótido que comprende: A) un polinucleótido exógeno o endógeno, y B) un elemento de respuesta, A) el polinucleótido exógeno o endógeno se encuentra funcionalmente ligado al elemento de respuesta, y B) la unión del dominio de unión a ADN al elemento de respuesta en presencia o en ausencia del ligando resulta en la activación o en la supresión del polinucleótido exógeno o endógeno, y C) uno de los dominios de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H y el otro dominio de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión a ligando de receptor nuclear capaz de formar un dímero con el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H, y b) cada sistema de regulación génica individualmente operable es ortogonal respecto a los demás sistemas de regulación génica individualmente operables presentes en el sistema de regulación de múltiples genes inducibles

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología o de la ingeniería genética. Más específicamente, la presente invención se refiere a un sistema de regulación de múltiples genes inducibles que funciona dentro de las células, tejidos u organismos no humanos controlando simultáneamente la expresión cuantitativa de dos o más genes.

Antecedentes de la invención

Se citan en la presente memoria diversas publicaciones. Sin embargo, la cita de cualquier referencia en la presente memoria no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia se encuentra disponible como "técnica anterior" a la presente solicitud.

En el campo de la ingeniería genética, el control preciso de la expresión génica es una herramienta valiosa para estudiar, manipular y controlar el desarrollo y otros procesos fisiológicos. La expresión génica es un proceso biológico complejo que implica varias interacciones específicas proteína-proteína. Con el fin de que la expresión génica resulte inducida, de manera que produzca el ARN necesario como primera etapa en la síntesis de proteínas, un activador transcripcional debe aproximarse a un promotor que controla la transcripción génica. Típicamente, el activador transcripcional mismo se asocia a una proteína que presenta por lo menos un dominio de unión a ADN que se une a sitios de unión a ADN presentes en las regiones promotoras de los genes. De esta manera, para que se produzca la expresión génica, debe transportarse una proteína que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de transactivación situado a una distancia apropiada del dominio de unión a ADN hasta la posición correcta en la región promotora del gen.

El enfoque transgénico tradicional utiliza un promotor que es específico de un tipo celular para controlar la expresión de un transgén de diseño. En primer lugar se incorpora en un genoma huésped un constructo de ADN que contiene el transgén. Al resultar inducido por un activador transcripcional, se produce la expresión del transgén en un tipo celular dado.

Un sistema de regulación de múltiples genes es un sistema que permite la regulación simultánea y cuantitativa de muchos genes diferentes en la misma célula, tejido u organismo. En la actualidad, en aplicaciones que van desde el análisis del genoma humano pasando por la proteómica hasta la producción de cantidades a gran escala de proteínas y las terapias génicas, no existe ninguna tecnología para regular simultáneamente más de un gen en la misma célula. La regulación génica resulta crítica en todas estas aplicaciones debido a que garantiza que, sea cual sea el gen que se analice, éste se encuentre bajo un control preciso y cuantitativo, y por lo tanto sean cuales sean los resultados obtenidos, estos se encuentran vinculados directa y específicamente a ese gen y no a otros. Sin embargo, en la actualidad la regulación génica se encuentra limitada a un gen cada vez, y esto supone una limitación cualitativa y cuantitativa significativa. El control paralelo de múltiples genes en la misma célula permite analizar fenómenos biológicos mucho más complejos, en los que se encuentran implicados múltiples genes, así como crear nuevas aplicaciones terapéuticas.

Otro medio para regular la expresión de genes foráneos en células utiliza promotores inducibles. Entre los ejemplos de este tipo de promotores se incluyen el promotor PR1-a, los sistemas procarióticos de represor-operador, los sistemas basados en moléculas inmunosupresoras y los sistemas de eucariotas superiores de activación de la transcripción.

El promotor PR1-a del tabaco resulta inducido durante la respuesta sistémica de adquisición de resistencia tras el ataque de patógenos. La utilización de PR1-a puede ser limitada debido a que con frecuencia responde a materiales endógenos y a factores externos tales como patógenos, radiación UV-B y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación génica basados en promotores inducidos por choque térmico, interferón y metales pesados (Wurn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5414-5418, 1986; Arnheiter et al., Cell 62:51-61, 1990; Filmus et al., Nucleic Acids Research 20:27550-27560, 1992). Sin embargo, estos sistemas presentan limitaciones debido a su efecto sobre la expresión de genes no diana. Estos sistemas también se encuentran débilmente regulados ("leaky").

Los sistemas procarióticos de represor-operador utilizan proteínas bacterianas represoras y las secuencias únicas de ADN operador a las que se unen. Los sistemas de represor-operador tanto tetraciclina ("Tet") como lactosa ("Lac") de la bacteria Escherichia coli han sido utilizados en plantas y animales para controlar la expresión génica. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora TetR resultando en un cambio conformacional que libera la proteína represora del operador que, como resultado, permite que se produzca la transcripción. En el sistema Lac, un operón Lac resulta activado en respuesta a la presencia de lactosa, o de análogos sintéticos tales como isopropil-b-D-tiogalactósido. Por desgracia, la utilización de dichos sistemas se encuentra restringida por la química inestable de los ligandos, es decir la tetraciclina y la lactosa, su toxicidad, su presencia natural o los niveles relativamente altos necesarios para la inducción o la represión. Por motivos similares, la utilidad de dichos sistemas en animales es limitada.

Las moléculas inmunosupresoras tales como FK506, la rapamicina y la ciclosporina A pueden unirse a las inmunofilinas FKBP12, a la ciclofilina, etc. Utilizando esta información, se ha diseñado una estrategia general para reunir dos proteínas cualesquiera simplemente colocando FK506 sobre cada una de las dos proteínas o colocando FK506 sobre una y ciclosporina A, sobre otra. A continuación, puede utilizarse un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto resultante de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) para inducir la dimerización de dichas moléculas (Spencer et al., Science 262:1019-24, 1993; Belshaw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4604-7, 1996). Se ha utilizado el dominio Gal4 de unión a ADN fusionado a FKBP12 y el dominio activador VP16 fusionado a ciclofilina y el compuesto FKCsA para mostrar la heterodimerización y la activación de un gen informador bajo el control de un promotor que contiene sitios de unión de Gal4. Por desgracia, este sistema incluye inmunosupresores que presentan efectos secundarios no deseados, lo que limita su utilización para diversas aplicaciones de sistema de regulación génica de mamíferos.

Los sistemas de activación transcripcional de los eucariotas superiores tales como los sistemas de receptores de hormonas esteroideas también han sido utilizados. Los receptores de hormonas esteroideas son miembros de la superfamilia de receptores nucleares y se encuentran en células de vertebrado y de invertebrado. Por desgracia, la utilización de compuestos esteroideos que activan los receptores para la regulación de la expresión génica, en particular en plantas y mamíferos, se encuentra limitada por su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en dichos organismos. Para superar estas dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo utilizando los receptores de la ecdisona de los insectos (EcR).

La diana molecular para la ecdisona en los insectos consiste de por lo menos un receptor de ecdisona (EcR) y la proteína Ultraspiracle (USP). El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores esteroideos nucleares, que se caracteriza a partir de su signatura de ADN y los dominios de unión a ligandos y por un dominio de activación (Koelle et al., Cell 67:59-77, 1991). El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares y se clasifica en subfamilia 1, grupo H (denominado en la presente memoria "receptores nucleares de grupo H"). Los miembros de cada grupo comparten una identidad de aminoácidos de 40% a 60% en el dominio E (de unión a ligando (Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, Cell 97:161-163, 1999). Además del receptor de ecdisona, entre otros miembros de esta subfamilia 1, grupo H de receptores nucleares se incluyen: el receptor ubicuo (UR), el receptor huérfano 1 (OR-1), el receptor nuclear 1 de hormonas esteroideas (NER-1), la proteína de interacción con RXR 15 (RIP-15), el receptor X hepático β (LXRβ), la proteína de tipo receptor de hormona esteroidea (RLD-1), el receptor hepático X (LXR), el receptor X hepático α (LXRα), el receptor... [Seguir leyendo]

1. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles, que comprende una pluralidad de sistemas de regulación génica individualmente operables, en el que:

a) cada sistema de regulación génica individualmente operable comprende:

i) uno o más polinucleótidos codificantes de un complejo de receptores que comprende:

A) un dominio de unión a ADN, B) un primer dominio de unión a ligando de receptor nuclear y un segundo dominio de unión a ligando de receptor nuclear, y C) un dominio de transactivación,

ii) un ligando,

iii) un polinucleótido que comprende:

A) un polinucleótido exógeno o endógeno, y

B) un elemento de respuesta,

en el que:

A) el polinucleótido exógeno o endógeno se encuentra funcionalmente ligado al elemento de respuesta, y B) la unión del dominio de unión a ADN al elemento de respuesta en presencia o en ausencia del ligando resulta en la activación o en la supresión del polinucleótido exógeno o endógeno, y C) uno de los dominios de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H y el otro dominio de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión a ligando de receptor nuclear capaz de formar un dímero con el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H, y

b) cada sistema de regulación génica individualmente operable es ortogonal respecto a los demás sistemas de regulación génica individualmente operables presentes en el sistema de regulación de múltiples genes inducibles.

2. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles según la reivindicación 1, en el que cada sistema de regulación génica individualmente operable comprende:

i) un primer casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado a un gen cuya expresión debe modularse y un primer dominio de unión a ligando de receptor nuclear,

ii) un segundo casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende un dominio de transactivación y un segundo dominio de unión a ligando de receptor nuclear,

iii) un ligando, y

iv) un tercer casete de expresión génica que comprende: A) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido del primer casete de expresión génica, B) un promotor que resulta activado por el dominio de transactivación del segundo polipéptido del segundo casete de expresión génica, y C) un gen cuya expresión debe modularse.

3. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles según la reivindicación 1 ó 2, en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H es un dominio de unión a ligando de receptor de la ecdisona y el otro dominio de unión a ligando de receptor nuclear capaz de formar un dímero con el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H se selecciona de entre el grupo constituido por un dominio de unión a ligando de receptor de la ecdisona, un dominio de unión a ligando del receptor X del retinoide de vertebrado, un dominio de unión a ligando del receptor X del retinoide de invertebrado, un dominio de unión a ligando de proteína Ultraspiracle, y un dominio de unión a ligando quimérico, que comprende por lo menos dos fragmentos polipeptídicos diferentes de dominio de unión a ligando de receptor nuclear seleccionados de entre el grupo constituido por un dominio de unión a ligando de receptor X del retinoide de vertebrado, un dominio de unión a ligando del receptor X del retinoide de invertebrado, y un dominio de unión a ligando de la proteína Ultraspiracle.

4. Virus que comprende el sistema de regulación de múltiples genes según la reivindicación 1 ó 2.

5. Virus según la reivindicación 4, en el que el virus es el virus Vaccinia, un adenovirus o un baculovirus.

6. Virus según la reivindicación 5, en el que dicho virus es un adenovirus.

7. Célula que comprende el sistema de regulación de múltiples genes inducibles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Célula según la reivindicación 7, en la que dicha célula es una célula vegetal.

9. Célula según la reivindicación 8, en la que la célula es una célula vegetal seleccionada de entre el grupo constituido por manzana, Arabidopsis, bajra, plátano, cebada, alubias, remolacha, soja verde, garbanzo, chili, pepino, berenjena, habas verdes, maíz, melón, mijo, alubia, avena, okra, Panicum, papaya, cacahuete, guisante, pimiento, guisante de paloma, piña, Phaseolus, patata, calabaza, arroz, sorgo, soja, calabacín, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, batata, té, tomate, tabaco, sandía y trigo.

10. Organismo transgénico no humano que comprende una o más células según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

11. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles según la reivindicación 1 ó 2, en el que uno o más de los polinucleótidos codificantes de un complejo de receptores codifica un complejo de receptores no de mamífero.

12. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 11, en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H es un dominio de unión a ligando de receptor de la ecdisona.

13. Procedimiento para desarrollar un sistema de regulación de múltiples genes inducibles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas siguientes:

a) definir un conjunto de ligandos modificados diversamente basado en cambios graduales de elemento farmacóforo,

b) preparar un primer conjunto de polipéptidos receptores nucleares, en el que cada polipéptido receptor nuclear comprende un dominio de unión a ligando que es:

i) natural, ii) modificado mediante deleción, inserción o mutación, iii) quimérico, iv) sintético, o v) una combinación de los mismos,

c) opcionalmente, introducir los polipéptidos receptores nucleares en una célula,

d) realizar una búsqueda entre los polipéptidos receptores nucleares en la célula de c) o in vitro, utilizando el conjunto de ligandos diversamente modificados para la modulación génica, o la unión a dominio de unión de ligando, o ambos,

e) determinar la ortogonalidad de las combinaciones de polipéptido receptor nuclear/ligando con el fin de definir un subconjunto de ligandos con diversas propiedades de modulación génica,

f) repetir opcionalmente las etapas a) a e) utilizando un conjunto modificado de ligandos y un conjunto modificado de polipéptidos receptores nucleares;

g) preparar un segundo conjunto de polipéptidos receptores nucleares, en el que cada polipéptido receptor nuclear comprende un dominio de unión a ADN que es:

i) natural, ii) modificado mediante deleción, inserción o mutación, iii) quimérico, iv) sintético, o v) una combinación de los mismos,

h) preparar un conjunto de constructos de ADN que comprende un gen exógeno o endógeno y elementos de respuesta que son:

i) naturales, ii) modificados mediante deleción, inserción o mutación, iii) quiméricos,

iv) sintéticos, o v) una combinación de los mismos,

i) clonar el primer conjunto de polipéptidos receptores nucleares y el segundo conjunto de polipéptidos receptores nucleares y los constructos de ADN y a continuación, introducir los clones en una célula,

j) someter a ensayo la célula para correactividad con los ligandos identificados en la etapa e), y,

k) seleccionar un conjunto ortogonal de ligandos, dominios de unión a ligando, dominios de unión a ADN, y elementos de respuesta, basándose en los resultados de las etapas e) y j), de manera que comprenda el sistema de regulación de múltiples genes inducibles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles que comprende una pluralidad de sistemas de regulación génica individualmente operables, en el que:

a) cada sistema de regulación génica individualmente operable comprende:

i) uno o más polinucleótidos codificantes de un complejo de receptores que comprende:

A) un dominio de unión a ADN, B) un dominio de unión a ligando, y C) un dominio de transactivación,

ii) un ligando, iii) un polinucleótido que comprende:

A) un polinucleótido exógeno o endógeno, y B) un elemento de respuesta,

en el que:

A) el polinucleótido exógeno o endógeno se encuentra funcionalmente ligado al elemento de respuesta, y B) la unión del dominio de unión a ADN al elemento de respuesta en presencia o en ausencia del ligando resulta en la activación o la supresión del polinucleótido exógeno o endógeno, y C) el complejo de receptores es un complejo de receptores nucleares de grupo H, y

b) cada sistema de regulación génica individualmente operable es ortogonal respecto a los demás sistemas de regulación génica individualmente operables presentes en el sistema de regulación de múltiples genes inducibles.

15. Sistema de regulación de múltiples genes inducibles según la reivindicación 14, en el que el complejo de receptores nucleares de grupo H es un complejo de receptores de la ecdisona.

16. Procedimiento para desarrollar un sistema de regulación de múltiples genes según la reivindicación 14 ó 15, que comprende las etapas de:

a) definir un conjunto de ligandos modificados de modo diverso, basándose en cambios graduales de elementos farmacóforos,

b) preparar un primer conjunto de polipéptidos receptores nucleares, en el que cada polipéptido receptor nuclear comprende un dominio de unión a ligando que es:

i) natural ii) modificado mediante deleción, inserción o mutación, iii) quimérico, iv) sintético, o v) una combinación de los mismos,

c) opcionalmente, introducir los polipéptidos receptores nucleares en una célula,

d) realizar una búsqueda de los polipéptidos receptores nucleares en la célula de c) o in vitro, utilizando el conjunto de ligandos diversamente modificados para la modulación génica, o la unión a dominio de unión a ligando, o ambos,

e) determinar la ortogonalidad de las combinaciones de polipéptido receptor nuclear/ligando con el fin de definir un subconjunto de ligandos con propiedades de modulación génica diversas, f) opcionalmente repetir las etapas a) a e) utilizando un conjunto modificado de ligandos y un conjunto modificado de polipéptidos receptores nucleares,

g) preparar un segundo conjunto de polipéptidos receptores nucleares, en el que cada polipéptido receptor nuclear comprende un dominio de unión a ADN que es:

i) natural, ii) modificado mediante deleción, inserción o mutación, iii) quimérico, iv) sintético, o v) una combinación de los anteriores,

h) preparar un conjunto de constructos de ADN que comprende un gen exógeno o endógeno y elementos de respuesta que son:

i) naturales, ii) modificados mediante deleción, inserción o mutación, iii) quiméricos, iv) sintéticos, o v) una combinación de los mismos,

i) clonar el primer conjunto de polipéptidos receptores nucleares y el segundo conjunto de polipéptidos receptores nucleares y los constructos de ADN y después introducir los clones en una célula,

j) someter a ensayo la célula para correactividad con los ligandos identificados en la etapa e), y

k) seleccionar un conjunto ortogonal de ligandos, dominios de unión a ligando, dominios de unión a ADN, y elementos de respuesta basándose en los resultados de las etapas e) y j), de manera que comprenda el sistema de regulación de múltiples genes inducibles según la reivindicación 14 ó 15.

17. Vector de expresión que comprende el sistema de regulación de múltiples genes inducibles según la reivindicación 1 ó 2.