SISTEMA DE DETECCION OPTICA PARA BIO-ENSAYOS DE ALTA SENSIBILIDAD SINMARCADO.

Sistema de detección óptica para bio-ensayos de alta sensibilidad sin marcado que comprende el uso de técnicas de caracterización óptica que permiten la interrogación vertical en dominios micro y sub-micrométricos así como al menos una celda resonante o interferométrica bio-fotónica de interrogación vertical caracterizado porque además comprende,

al menos:(i) un sistema óptico de medida que comprende, a su vez, y al menos una fuente de excitación, medios ópticos de detección de la señal procedente de un cabezal óptico; y un cabezal óptico; y(ii) un elemento para la integración de múltiples analitos comprendiendo, a su vez y al menos, una pluralidad de celdas bio-sensibles, una pluralidad de conexiones fluídicas conectadas con las celdas; y un sustrato sobre el que reposan tanto las celdas bio-sensibles como las conexiones fluídicas;y donde dicho cabezal óptico está configurado para analizar cada una de dichas celdas bio-sensibles y los analitos contenidos en ellas

Sistema de detección óptica para bio-ensayos de alta sensibilidad sin marcado.

El objeto de la invención está basado en el diseño. y desarrollo holístico del sistema de bio-detección al conjuntar las ventajas interferométricas y resonantes de estructuras fotónicas novedosas con técnicas de interrogación óptica como espectrometría, elipsometría así como reflectancia y/o transmitancia resuelta en ángulo de forma simultánea en micro/sub-micro dominios, haciendo que el sistema en su conjunto ofrezca máxima sensibilidad y robustez, eliminando ambigüedades en el proceso de interrogación óptica. Dichas cavidades son compatibles y están adaptadas a los requerimientos fluídicos necesarios para llevar a cabo bio-ensayos sin marcado. Además, el resultado de la medida se podrá obtener en un corto intervalo de tiempo, en pocos segundos. El campo de aplicación de la presente invención se enmarca dentro de la ingeniería y la fisica, y en concreto, dentro del área bio-fotónica, materiales, óptica y micro-nanotecnología.

Antecedentes de la invención

Sectores como el biomédico y clínico están demandando continuamente mejores y más eficaces técnicas y herramientas de análisis para la identificación de enfermedades, desarrollo de nuevos medicamentos y mejoras de rendimiento en el diagnóstico. Para lograr este objetivo, los sistemas de detección compuestos por materiales ópticos y componentes fotónicos, como base para el desarrollo de sistemas de bio-detección óptica, se están posicionando como una alternativa significativa de gran potencial (Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review, Anal. Chim. Acta 620, pp. 8-26, 2008. doi:10.1016/j.aca.2008.05.022.). Además del alto grado de sensibilidad que estos sistemas pueden llegar a alcanzar, ofrecen otras ventajas como: no son invasivos, ausencia de riesgo de descargas eléctricas o explosiones y su inmunidad a interferencias electromagnéticas. Un aspecto clave para el desarrollo de estos sistemas se sustenta en el grado de desarrollo de la tecnología de miniaturización a micro y nano escala, capaz de integrar componentes mecánicos, fluídicos y fotónicos para desarrollar eficientes bio-sistemas de detección.

El proceso de averiguar si determinados patógenos o proteínas se encuentran en un determinado analito en los sistemas ópticos de bio-detección es realizado mediante la inmovilización de bioreceptores sobre áreas específicas del sensor. Una vez realizado el proceso de inmovilización es cuando se introducen los analitos de prueba en dichas áreas, los cuales reaccionaran si tienen contenidos determinados patógenos o proteínas que sean captados por los ya comentados receptores moleculares inmovilizados, en un proceso que se denomina reconocimiento molecular (RM). Este proceso de reconocimiento es monitorizado la mayoría de las veces mediante técnicas que requieren para su transducción elementos de marcado tales como colorantes fluorescentes, isótopos radioactivos o partículas magnéticas, entre otros. Sin embargo, la química asociada al proceso de marcaje implica mayor tiempo y coste económico. Por el contrario, los bio-sensores ópticos refractométritos no requieren este tipo marcaje para la detección, lo que se denomina sistemas de bio-detección sin marcado (label-free biosensing). Se espera que los sistemas de bio-detección sin marcado crezcan más en importancia en sectores como el clínico, biofarmaceútico, medioambiental, seguridad, entre otros debido a su sensibilidad y capacidad para la realización de análisis en tiempo real, ahorro de reactivos y analitos y en definitiva menor coste por análisis.

La tecnología de miniaturización e integración a micro-nano escala está logrando resultados prometedores para el desarrollo de nuevos sensores para bio-detección sin marcado. Se han desarrollado dispositivos nano-mecánicos como por ejemplo microvoladizos resonantes (resonant microcantilevers), y resonadores acústicos basados en MEMS (Micro Electro Mechanical Systems). Sin embargo, la sensibilidad que ofrecen es considerablemente menor que los dispositivos fotónicos integrados. Los dispositivos fotónicos integrados para su aplicación como biosensores refractométritos son especialmente relevantes cuando son fabricados utilizando técnicas convencionales de tecnología plana de micro-nano-fabricación, lo que permite la miniaturización, reducción de coste, fabricación a gran escala, estabilidad mecánica y posibilidad de fabricar componentes ópticos, fluídicos, eléctricos y fotónicos necesarios para conseguir dispositivos monolíticos y compactos de alta sensibilidad, y con capacidad para medir diferentes analitos de forma simultánea. Los sistemas de detección óptica refractométritos utilizan como transducción el efecto que provoca tanto la inmovilización de biomoléculas como el reconocimiento molecular en variaciones de índice de refracción. En la actualidad se han desarrollado y demostrado bio-sensores ópticos refractométritos en tecnología plana de micro/nano fabricación que suelen emplear el campo evanescente de un modo de luz guiado por una guía de onda de alto índice de refracción y están basados en estructuras fotónicas tales como el plasmón de resonancia superficial (SPR), interferométros, resonadores, redes de difracción y cristales fotónicos. Sin embargo, este tipo de dispositivos fotónicos suele necesitar de técnicas complejas de acoplamiento por ejemplo entre la guía de onda y la fibra óptica (p.e. guías de estrechamiento invertido y acopladores basados en redes de difracción) para obtener la información, lo cual dificulta el encapsulado y empaquetamiento de los mismos y repercute drásticamente en el coste del dispositivo.

Algunos de estos sensores han sido ya comercializados, otros están en fase de comercialización, y algunos todavía no han sido comercializados, que se describen a continuación:

1.- Biosensores sensores refractométritos basados en la resonancia del plasmón superficial, en ingles "Surface plasmon resonance" (SPR)

Desde sus descubrimiento en 1983, es una de las técnicas ópticas más exitosas para biosensores sin marcado, está aceptada comercialmente y es distribuida por ejemplo por las firmas comerciales Biacore (www.biacore.com) e Ibis Technologies (www.ibis-spr.nl) entre otras. La técnica SPR es utilizada ampliamente para la determinación de muchos tipos de interacciones biológicas y cientos de publicaciones aparecen en la literatura cada año. También existe un elevado número de patentes, a modo de ejemplo se referencia algunas de ellas: US5492840, US2008193965, US2064090630, WO2008101348, WO2008054282, al igual que referencias científicas (Analysis of the performance of interferometry, surface plasmon resonance and luminescente as biosensors and chemosensors, Review. Anal. Chim. Acta 569 (1-2), pp. 1-20, 2006. doi:10.1016/j.aca.2006.03.058.) y (Surface plasmon resonance sensors: review, Sensors and Actuators B: Chemical 54 (1-2), pp. 3-15, 1999. doi:10.1016/S0925-4005(98)00321-9.). La desventaja de este sistema con el que se propone en la presente invención se funda en que estos sistemas son más lentos, no se pueden miniaturizar tanto para alcanzar una alta integración en dispositivos, no son de alta cadencia de medida, y por tanto son de mayor coste económico por análisis.

2.- Biosensores refractométritos basados en interferómetros

Existen varios tipos de biosensores refractometrícos basados en interferometría, de los cuales se destacan: Ineterferómetro de Young, los basados en redes de difracción y los interferómetros Mach-Zehnder:

2.1.- Interferómetro de Young (I-Y): Comercializado por la empresa Farfield Group (www.farfield-scientific.com) ofrece alta sensibilidad. Consiste en cuatro láminas dieléctricas, dos de ellas son el área sensible y las otras dos como referencia. La interferometría entre las dos señales permite determinar la detección (US 7050176B1) y (A new quantitative optical biosensor for protein characterisation, Biosensors and Bioelectronics 19 (4), pp. 383-390, 2003. doi:10.1016/S0956-5663(03)00203-3). También puede utilizar la polarización para la excitación. Sin embargo, es una técnica en la que la posibilidad de integrar múltiples chips es más complejo en comparación con otras técnicas, siendo por tanto la capacidad de integración y la cadencia de medida inferior y el coste por análisis mayor en comparación con el sistema de bio-detección que se propone en la presente invención.

1. Sistema de detección óptica para bio-ensayos de alta sensibilidad sin marcado que comprende el uso de técnicas de caracterización óptica que permiten la interrogación vertical en dominios micro y sub-micrométricos así como al menos una celda resonante o interferométrica bio-fotónica de interrogación vertical caracterizado porque además comprende, al menos:

(i) un sistema óptico de medida que comprende, a su vez, y al menos una fuente de excitación, medios ópticos de detección de la señal procedente de un cabezal óptico; y un cabezal óptico; y

(ii) un elemento para la integración de múltiples analitos comprendiendo, a su vez y al menos, una pluralidad de celdas bio-sensibles, una pluralidad de conexiones fluídicas conectadas con las celdas; y un sustrato sobre el que reposan tanto las celdas bio-sensibles como las conexiones fluídicas;

y donde dicho cabezal óptico está configurado para analizar cada una de dichas celdas bio-sensibles y los analitos contenidos en ellas.

2. Sistema según reivindicación 1 caracterizado porque dichas fuente de excitación son de tipo láser u otras coherentes o no en longitudes de onda visible e infrarrojo.

3. Sistema según reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque el elemento de integración de múltiples analitos es un sustrato de gran tamaño tipo oblea de silicio, vidrio transparente o similar.

4. Sistema según reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque el elemento de integración de múltiples analitos es un bio-chip desechable.

5. Sistema según reivindicaciones 1, 2 y 3 o 4 caracterizado porque la celda biosensible de interrogación vertical está basada en fenómenos interferométricos y/o resonantes sensibles a reconocimiento molecular cuando se interrogan verticalmente.

6. Sistema según reivindicaciones anteriores caracterizado porque la celda bio-sensible está basada en una nano-cavidad resonante con interrogación por reflexión o transmisión, con reflectividad en función del ángulo de incidencia, de la longitud de onda y donde la diferencia de fase es obtenida de forma simultánea y donde dicha celda bio-sensible comprende, al menos:

(a) una pluralidad de reflectores de Bragg;

(b) una cavidad resonante;

(c) una pluralidad de biomoléculas, los cuales entran por una entrada de fluidos y salen por una salida de fluidos;

estando, además, la pluralidad de reflectores de Bragg, la cavidad resonante y la pluralidad de biomoléculas, depositados sobre un sustrato.

7. Sistema según reivindicaciones 1, 2 y 3 o 4 caracterizado porque la celda bio-sensible está basada en micro-pilares resonantes de interrogación por reflexión o transmisión y comprende, al menos:

(a) una pluralidad de cavidades resonantes;

(b) una pluralidad de anticuerpos/antígenos adheridos a la superficie de las cavidades resonantes;

(c) una pluralidad de reflectores de Bragg, al menos dos por cavidad resonante;

estando además dichos elementos depositados sobre un sustrato.

8. Sistema según reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, 5 y 6 o 7 caracterizado porque en interrogación por transmisión, el cabezal óptico es un cabezal óptico emisor conectado a la fuente de excitación cuyo haz es recibido por un cabezal óptico receptor, conectado a los medios ópticos de detección.

9. Sistema según reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, 5 y 6 o 7 caracterizado porque en interrogación por reflexión, el cabezal óptico es emisor-receptor.