siRNA y shRNA para la elaboración de medicamentos frente a la presión intraocular elevada.

La presente invención proporciona moléculas de siRNA y de shRNA para silenciar de manera selectiva el gen del receptor purinérgico P2Y{sub,2}. Estas moléculas son útiles para la elaboración de composiciones farmacéuticas con capacidad de disminuir la presión intraocular por lo que su aplicación es de utilidad en aquellas enfermedades que cursan con presión intraocular elevada como son el glaucoma, la uveítis, la retinopatía diabética así como determinadas enfermedades infecciosas o sistémicas

siRNA y shRNA para la elaboración de medicamentos frente a la presión intraocular elevada.

Campo de la invención

La presente invención trata de la elaboración de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la hipertensión ocular. Más concretamente se refiere al empleo de la tecnología de los siRNA para silenciar de manera selectiva el gen del receptor purinérgico P2Y₂.

Estado de la técnica

Desde hace relativamente poco tiempo los investigadores han observado que el RNA de doble hebra (dsRNA, del inglés doble strand RNA) tiene propiedades interesantes al ser capaz de inhibir la expresión de genes. Esta capacidad de silenciar un gen tiene un amplio potencial para el tratamiento de algunas enfermedades humanas motivo por el cual tanto empresas como laboratorios de las universidades están poniendo un gran esfuerzo en el desarrollo de nuevas terapias basadas en esta tecnología.

Se considera que el mecanismo principal que tiene el dsRNA para inducir el silenciamiento de genes en mamíferos es la degradación del RNA mensajero (mRNA). En este caso, al dsRNA que degrada el mRNA se le llama siRNA (del inglés small interference RNA) o iRNA (interferente RNA).

Los primeros abordajes para el uso de dsRNA con el fin de silenciar un gen en particular tuvieron como resultado la síntesis de cadenas demasiado grandes que condujeron a fenómenos no deseados. De hecho, se ha comprobado que existe una limitación en mamíferos: siRNA de longitud superior a 30 nucleótidos producen respuesta inespecífica a interferón debido a que activan un mecanismo celular de defensa ante infecciones víricas. Esta observación puso de manifiesto la necesidad de buscar cadenas de dsRNA que no fuesen demasiado grandes.

Recientemente, se ha podido comprobar que cadenas entre 18 y 30 pares de bases de dsRNA pueden entrar en células y tejidos y, si su secuencia está bien escogida, pueden destruir selectivamente un mRNA sin disparar la respuesta del interferón. A estas moléculas de dsRNA con una secuencia específica para destruir a su vez a un mRNA en particular se les ha denominado siRNA, como se ha descrito anteriormente.

La estructura de los denominados siRNA proviene del procesamiento de los dsRNA por mediación del enzima DICER, una proteína que pertenece a la familia de la RNasa III, que escinde el dsRNA en fragmentos pequeños. Un complejo de proteínas denominado RISC (del inglés RNA induced silencing complex) recoge estos siRNA y a continuación busca y destruye cualquier RNA presente en la célula con una secuencia complementaria, como es el mRNA diana para el que se diseñó el dsRNA. El mecanismo de acción de los siRNA así como algunos de sus usos se pueden ver en las siguientes referencias: Provost et al. (2002) Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer, EMBO J. 21(21): 5864-5874; Tabara et al. (2002) The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-1, DCR-1 and a DexH-box Helicase to Direct RNAi in C. elegans, Cell 109(7):861-71; Martínez et al., (2002) Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi, Cell 110(5):563-574; Hutvagner & Zamore (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 297:2056; (para la revisión vea Bosher & Labouesse (2000) RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat. Cell. Biol. 2 (2): E31-E36). De modo resumido, el fenómeno de la interferencia o silenciamiento del RNA se completa mediante los siguientes pasos: (i) en primer lugar se produce el reconocimiento del dsRNA y la unión a DICER; (ii) a continuación, la actividad RNasa III de DICER produce la escisión del dsRNA dando lugar a la producción de siRNA; (iii) se produce la asociación de los siRNA al complejo proteico RISC que (iv) reconoce el mRNA complementario diana y (v) induce la ruptura del mRNA diana en el centro de la región complementaria al siRNA; (vi) el último paso consiste en la degradación del mRNA diana y el reciclaje del complejo RISC.

Las dos principales ventajas de esta tecnología consisten en que el efecto es bastante más duradero que el de un fármaco normal y que la interferencia se mantiene, in vitro, después de numerosas divisiones celulares. Otra característica fundamental es que el siRNA se diseña de manera específica por lo que se puede inhibir la expresión de un gen sin afectar a ningún otro (Kisielow, M. et al. (2002) Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA, J. Biochem. 363:1-5). Esto no solo permite aplicaciones selectivas para patologías muy complejas sino que, además, los siRNA pueden emplearse para comprobar la participación de un determinado gen (y por ende su proteína) en los procesos bioquímicos y fisiológicos de una célula.

Se han utilizado diversos sistemas en los que, con el empleo de siRNA, se ha logrado la supresión específica de la biosíntesis de proteínas en diferentes líneas celulares mamíferas, de modo que este método ha permitido asignar una función a los genes. Por ejemplo, se ha podido demostrar la inhibición de la expresión génica a nivel postranscripcional en células eucarióticas. En este contexto, los iRNA son una herramienta excelente para evaluar rápidamente la función del gen y para revelar fenotipos nulos.

Más allá de los posibles papeles de este tipo de RNA como herramienta para comprender el significado de los genes está el empleo con fines terapéuticos. De este modo se podría emplear los iRNA para tratar enfermedades.

El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa que ocurre en muchos casos como consecuencia del incremento en la presión intraocular (PIO) que estrangula la arteria ciliar privando de flujo sanguíneo a la retina e induciendo la muerte de las células retinianas con la consiguiente pérdida de visión. Si la PIO es muy elevada el nervio óptico puede ser incluso estrangulado con lo que el proceso es, si cabe, más grave. El caso más habitual de glaucoma es el que se acaba de comentar, que se denomina de ángulo abierto, y su prevalencia es notable en mayores de 40 años, entre quienes tiene una incidencia de un caso cada 200 personas.

No se conocen bien los motivos que pueden desencadenar el glaucoma, pero parece que podría tener un componente genético. Por ejemplo, el gen de la miocilina, presenta más de 30 mutaciones y se ha comprobado que es responsable del 5% de los casos de glaucoma de ángulo abierto (véase las revisiones en Wirtz & Samples (2003) The genetic loci of open angle glaucoma. Ophtalmopl. Clin. North Am. 16: 505-514, y Khaw et al., (2004) Glaucoma -1: diagnosis. BMJ, 328: 97-99).

Las terapias que actualmente se están desarrollando frente al glaucoma pasan por la cirugía y la farmacología, con el fin de hacer caer la presión intraocular anormalmente elevada en estos pacientes. Al margen de la cirugía, la farmacología se lleva a cabo por medio de 5 tipos de familias de fármacos:

Inhibidores de las anhidrasas carbónicas;

Agentes betabloqueantes;

Agentes agonistas alfaadrenérgicos;

Parasimpáticomiméticos;

Análogos de las protaglandinas.

Todas y cada una de estas aproximaciones presentan ventajas e inconvenientes y son precisamente los inconvenientes los que demandan la generación de nuevas estrategias para el tratamiento de esta patología.

Recientemente en la patente WO2006021817 se describe el diseño y empleo de iRNA para el tratamiento de las patologías oculares y en particular en el tratamiento del glaucoma. Sin embargo, las dianas seleccionadas por los inventores nada tienen que ver, ni ponen en compromiso alguno, con la invención que aquí se describe. La mencionada patente reivindica 1829 secuencias oligonucleotídicas para las anhidrasas carbónicas II, IV y XII, para los receptores adrenérgicos beta1 y beta2, alfala, para la acetilcolinesterasa, ciclooxigenasas 1 y 2, ATPasas, ELAM, el sistema renina angiotensina y la coclina. En ningún momento se reivindica el uso de un iRNA para silenciar el gen de la proteína que se reivindica en este documento.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un siRNA para la elaboración de medicamentos frente a la presión intraocular elevada en animales y humanos. Patologías como el glaucoma, la uveitis y los procesos inflamatorios suelen ocurrir con incrementos notables de la presión intraocular. El siRNA de la invención es específico para el silenciamiento del gen... [Seguir leyendo]

1. Molécula aislada de siRNA que comprende una secuencia de 19 nucleótidos complementaria a la secuencia diana SEQ ID NO 1 del gen del receptor purinérgico P2Y₂.

2. Molécula aislada de siRNA, según la reivindicación 1, cuya secuencia contiene hasta 7 nucleótidos más que SEQ ID NO 1 distribuidos indistintamente en ambos extremos.

3. Molécula aislada de siRNA, según la reivindicación 1, cuya secuencia contiene dos nucleótidos más que SEQ ID NO 1 en el extremo 3' de cada una de las hebras siendo esos dos nucleótidos o bien dos desoxitiminas (TT) o bien dos uridinas (uu).

4. Molécula aislada de siRNA, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene nucleótidos modificados químicamente.

5. Composición farmacéutica que comprende la molécula de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Uso de la molécula de RNA de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para elaborar un medicamento para el tratamiento de la presión intraocular elevada.

7. Uso, según la reivindicación 6, donde la presión intraocular elevada está causada por glaucoma.

8. Uso, según la reivindicación 6, donde la presión intraocular elevada está causada por retinopatía diabética.

9. Uso, según la reivindicación 6, donde la presión intraocular elevada está causada por una uveítis.

10. Uso, según la reivindicación 6, donde la presión intraocular elevada está causada por una enfermedad sistémica.

11. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento se administra tópicamente en el ojo del paciente.

12. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento se administra en el ojo del paciente a través de una inyección intracamerular.

13. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento se administra en el ojo del paciente a través de una inyección subconjuntival.

14. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento se administra en el ojo del paciente a través de una inyección intravitrea.

15. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el medicamento se administra en la córnea del paciente.

16. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6-15, donde el paciente es un ser humano.