SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO DE PROTEASA ESPECÍFICA DE INSECTOS.

Secuencias de reconocimiento de proteasa específica de insectos Campo de la invención La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular de plantas y del control de plagas de plantas. Antecedentes de la invención Las plagas de insectos son un factor fundamental en la pérdida de cultivos agrícolas de todo el mundo. Por ejemplo, los daños producidos por el gusano de la raíz del maíz o por el picudo peruano pueden ser económicamente devastadores para los productores agrícolas. La pérdida de cultivos en relación con plagas de insectos ha alcanzado, sólo en lo que respecta al gusano de la raíz del maíz, el billón de dólares anual. Tradicionalmente, los principales procedimientos para afectar a las poblaciones de plagas de insectos, tales como las poblaciones del gusano de la raíz del maíz, son la rotación de cultivos y la aplicación de pesticidas químicos sintéticos de amplio espectro. No obstante, los consumidores y los reguladores de los gobiernos cada vez están más preocupados por los riesgos para el medioambiente asociados con la producción y uso de pesticidas químicos sintéticos. Debido a estas preocupaciones, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los pesticidas más peligrosos. Por tanto, existe un considerable interés en el desarrollo de pesticidas alternativos. El control biológico de plagas de insectos de significado agrícola usando un agente microbiano, tal como hongos, bacterias u otras especies de insectos, proporciona una alternativa ecológica y comercialmente atractiva. En términos generales, el uso de biopesticidas supone un riesgo menor de polución y riesgos ambientales, y proporciona una especificidad de diana mayor de la característica de los insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales. Además, los biopesticidas a menudo son más baratos de producir y, por tanto, se mejora el rendimiento económico para una amplia variedad de cultivos. Se sabe que ciertas especies de microorganismos del género Bacillus poseen actividad pesticida contra una amplia gama de plagas de insectos, incluidos Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera, y otros. Bacillus thuringiensis y Bacillus papilliae están entre los agentes de biocontrol con más éxito descubiertos hasta la fecha. La patogeneicidad de insectos se ha atribuido a las cepas de: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, B. thuringiensis (Harwook, ed. (1989) Bacillus (Plenum Press), p. 306) y B. cereus (documento WO 96/10083). Parece que la actividad pesticida está concentrada está concentrada en inclusiones proteicas cristalinas parasporales, aunque las proteínas pecticidas también se han aislado de la etapa de crecimiento vegetativo de Bacillus. Se han aislado y caracterizado Varios genes que codifican estas proteínas pesticidas (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.366.892 y 5.840.868). Los pesticidas microbianos, particularmente los obtenidos de las cepas de Bacillus, han desempeñado un papel importante en la agricultura como alternativas al control químico de las plagas. Recientemente, los científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con resistencia potenciada a insectos mediante ingeniería genética de las plantas de cultivo para producir proteínas pesticidas de Bacillus. Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón sometidas a ingeniería genética para producir proteínas pesticidas aisladas de cepas de B. thuringiensis, conocidas como -endotoxinas o toxinas Cry (véase Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf y col. (1998) Microbiol. Mol. BioI. Rev. 62(3):775-806) actualmente se usan ampliamente en la agricultura americana y han proporcionado al agricultor una alternativa ecológica a los procedimientos de control de insectos tradicionales. Además, las patatas sometidas a ingeniería genética para que contengan toxinas Cry pesticidas se han comercializado para el agricultor americano. No obstante, aunque se ha probado que tienen mucho éxito comercial, estas plantas de cultivo resistentes a insectos modificadas genéticamente sólo proporcionan resistencia a una amplia gama de las plagas de insectos importantes económicamente. Se ha demostrado que algunos insectos, tales como el gusano de la raíz del maíz occidental, son recalcitrantes. De acuerdo con esto, se han realizado esfuerzos para entender el mecanismo de acción de las toxinas Bt y para modificar las toxinas con propiedades mejoradas. Se ha demostrado que las proteasas de intestino pueden afectar al impacto de las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis y otras proteínas pesticidas del insecto. Algunas proteasas activan las proteínas Cry procesándolas a partir de una forma de protoxina en una forma tóxica o toxina. Véase, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12 y Carroll y col. (1997) J. Invertebrate Pathology 70:41-49. Esta activación de la toxina puede incluir la eliminación de los péptidos en N-terminal y C-terminal de la proteína y también pueden incluir la escisión interna de la proteína. Otras proteasas pueden degradar las proteínas pesticidas. Véase Oppert, ibid.; véase también las patentes de EE.UU. nº 6.057.491. y 6.339.491. Los investigadores han determinado que las plantas expresan diversas proteasas, incluidas serina y cisteína proteasas. Véase, por ejemplo, Goodfellow y col. (1993) Plant Physiol. 101:415-419; Pechan y col. (1999) Plant Mol. BioI. 40: 111-119; Lid y col. (2002) Proc. , Nat. Acad. Sci. USA 99:5460-5465. La investigación también que las proteasas de intestino de insecto incluyen catepsinas, tales como proteinasas similares a la catepsina B y L. Véase 2   Shiba y col. (2001) Parch. Biochem. Biophys. 390: 28-34; véase también Purcell y col. (1992) Insect Biochem. Mol. BioI. 22:41-47. Por ejemplo, las cisteína proteinasas similares a la catepsina L se encuentras en el intestino medio de las larvas del gusano de la raíz del maíz occidental. Véase, Koiwa y col. (2000) FEBS Letters 471 :67-70; véase también, Koiwa y col. (2000) Analytical Biochemistry 282: 153-155. Los sitios sustrato proteolíticos preferidos de estas proteasas se han investigado usando sustratos sintéticos. Véase Alves y cool., (2001) Eur. J. Biochem 268: 1206-1212 y Melo y col., (2001) Anal. Biochem. 293:71-77. Aunque los investigadores ya han modificado genéticamente plantas, particularmente plantas de cultivos, para que contengan toxinas Cry biológicamente activos (es decir, pesticidas), hasta la fecha los investigadores no han usado de forma efectiva las formas protoxina de los polipéptidos pesticidas junto con proteasas de intestino de insectos para controlar plagas de plantas. Además, estas proteínas extrañase pueden ser degradadas e inactivadas por las proteasas presentes en estas plantas transgénicas. Por tanto es deseable disponer de nuevas estrategias para modificar toxinas de insectos y usar estas toxinas modificadas en las estrategias para controlar las plagas. El documento WO 2004/003148 divulga -endotoxinas que se han modificado para que tenga al menos un sitio proteolítico sensible a catepsina. El documento WO 02/34774 divulga -endotoxinas que son activas contra plagas de coleópteros y -endotoxinas modificadas con mejor actividad pesticida o especificidad alterada por la plaga. El documento US 2003/120054 divulga toxinas Cry3A modificadas que tienen mayor toxicidad contra el gusano de la raíz del maíz. El documento WO 95/02693 divulga toxinas Bt con actividad contra dípteros y/o el gusano de la raíz del maíz. El documento US 2002/038005 divulga dos -endotoxinas, Cry26Aa1 y Cry28Aa1 Resumen de la invención Se proporcionan composiciones y los procedimientos para proteger una plata de una plaga de insectos. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican protoxinas de insectos o toxinas de insectos que comprenden al menos un sitio de activación proteolítica que se ha modificado para comprender un sitio de escisión que es sensible a una proteasa de intestino de insecto. Normalmente, el sitio de activación proteolítica se modifica dentro de una región de activación de la protoxina de insectos o toxina de insectos. La escisión proteolítica de una protoxina de insecto modificada mediante la proteasa de intestino de insecto libera la toxina de insecto activada dentro del intestino del insecto. La escisión de una toxina de insecto modificada mediante la proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto con mejor actividad pesticida en el intestino del insecto con respecto a la correspondiente toxina de insecto que carece del sitio de activación proteolítica. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar unidas de forma operable a cualquier promotor de interés para dirigir la expresión de las protoxinas de insecto o toxinas de insecto modificadas en una planta o célula vegetal.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una protoxina de insectos que tiene al menos un sitio de activación proteolítica que se ha modificado para comprender un sitio de escisión que es sensible a una cisteína proteasa de intestino de insecto y en el que la escisión de dicha protoxina de insecto por dicha cisteína proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa; en el que dicho sitio de escisión se introduce en la unión entre el segmento de formación cristalina en N-terminal de la protoxina y la porción C-terminal de la protoxina que comprende la toxina de insecto activa después de la escisión; en el que dicha toxina de insecto activa es una toxina Cry de Bacillus thuringiensis o una variante o fragmento de la misma, en el que dicha variante y dicho fragmento tienen actividad pesticida y dicha variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con una secuencia de aminoácido de dicha toxina Cry de Bacillus thuringiensis; y en el que dicho sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos LXQS (SEC ID Nº 1). 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dicho sitio de escisión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LXQS (SEC ID Nº 2) LSQSLSQS (SEC ID Nº 3) y LSQSLSQS (SEC ID Nº 4). 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que además comprende fabricar composiciones que comprenden dicha protoxina de insecto para usar en el control de plagas de plantas. 4. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una protoxina de insecto, en la que dicha protoxina de insecto tiene al menos un sitio de activación proteolítica que se ha modificado para comprender un sitio de escisión que es sensible a una cisteína proteasa de intestino de insecto y en el que la escisión de dicha protoxina de insecto por dicha cisteína proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa; en el que dicha toxina de insecto activa es una toxina Cry de Bacillus thuringiensis o una variante o fragmento de la misma, en el que dicha variante y dicho fragmento tienen actividad pesticida y dicha variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con una secuencia de aminoácido de dicha toxina Cry de Bacillus thuringiensis; y en el que dicho (a) dicho sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos LXQS (SEC ID Nº 1) y se introduce en la unión entre el segmento de formación cristalina en N-terminal de la protoxina y la porción C- terminal de la protoxina que comprende la protoxina de insecto activa después de la escisión; (b) dicho sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos LXQS (SEC ID Nº 1) en el que dicha toxina de insecto activa es una toxina Cry de Bacillus thuringiensis es una toxina Cry8 o una variante o fragmento de la misma, en el que dicha variante y dicho fragmento tienen actividad pesticida y dicha variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con una secuencia de aminoácido de dicha toxina Cry8 ; y/o (c) dicho sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos LXQSLXQS (SEC ID Nº 3) o LSQSLSQS (SEC ID Nº 4). 5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4(a) o 4(b), en la que el dicho sitio de escisión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LXQS (SEC ID Nº 2) LSQSLSQS (SEC ID Nº 3) y LSQSLSQS (SEC ID Nº 4). 6. Un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 4 o 5 unida de forma operable a un promotor que dirige la expresión en una planta. 7. Un procedimiento para proteger una planta de una plaga de insectos, comprendiendo dicho procedimiento la introducción en dicha planta de al menos una construcción de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 4 o 5 unida de forma operable a un promotor que dirige la expresión en dicha planta, en el que la expresión de dicha construcción de polinucleótidos produce dicha protoxina de insecto en dicha planta, en el que dicha plaga de insecto ingiere dicha planta y dicha protoxina de insecto y en el que la escisión de dicha protoxina de insecto mediante dicha cisteína proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa en el intestino de dicha plaga de insecto. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7, en el que dicha protoxina de insecto tiene actividad pesticida mejorada respecto a una protoxina de insecto que carece de dicho al menos un sitio de activación proteolítico modificado. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 a 8, en el que dicho sitio de activación proteolítico estabiliza además dicha protoxina de insecto en la planta. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 a 9, en el que dicha plaga de insectos se selecciona del escarabajo de la patata de Colorado, el gusano de la raíz del maíz occidental, el gusano de la raíz del maíz del sur, el gusano de la raíz del maíz del norte y el picudo. 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 a 10, en el que dicha cisteína proteasa es 56   una proteasa de tipo L. 12. Una planta transforma que comprende al menos una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 4 o 5 unida de forma operable a un promotor que dirige la expresión en dicha planta. 13. La planta de la reivindicación 12, en la que dicha construcción de polinucleótidos se incorpora de forma estable en el genoma de la planta. 14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 a 11, o la planta de la reivindicación 12 o 13. en el que dicha planta es una monocotiledónea. 15. El procedimiento o planta de la reivindicación 14, en el que dicha monocotiledónea es maíz. 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 a 11, o la planta de la reivindicación 12 o 13, en el que dicha planta es una dicotiledónea. 17. El procedimiento o planta de la reivindicación 16, en el que dicha dicotiledónea es soja. 18. El casete de expresión de la reivindicación 6 o la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7 a 11, en el que dicho promotor es un promotor preferido de la raíz. 19. Una semilla transgénica de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en la que la semilla comprende dicha construcción de polinucleótidos. 20. Una protoxina de insecto aislada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 o 5. 21. Una composición que comprende al menos una protoxina de insecto de acuerdo con la reivindicación 20 en combinación con un vehículo. 22. Un procedimiento para afectar a una plaga de insectos que comprende aplicar la composición de acuerdo con la reivindicación 21 en el ambiente de dicha plaga de insectos mediante un procedimiento seleccionado de pulverización, espolvoreado, transmisión y recubrimiento de semillas. 57