REORGANIZACIONES Y MUTACIONES MITOCONDRIALES COMO HERRAMIENTAS DE DIGANÓSTICO PARA LA DETECCIÓN DE EXPOSICIÓN SOLAR, CÁNCER DE PRÓSTATA Y OTROS CÁNCERES.
Un método de detección de una deleción que abarca aproximadamente los nucleótidos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt humano,
en el que dicha deleción está asociada con cáncer de próstata, en un sujeto que tiene ADNmt, que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica obtenida del sujeto; y (b) detectar la presencia de la deleción en el ADNmt
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA2006/000652.
Solicitante: MITOMICS INC.
Nacionalidad solicitante: Canadá.
Dirección: SUITE 1000 290 MUNRO STREET THUNDER BAY, ON P7A 7T1 CANADA.
Inventor/es: THAYER,ROBERT, PARR,RYAN, DAKUBO,GABRIEL, MAKI,JENNIFER, AGUIRRE,ANDREA, BIRCH-MACHIN,MARK, REGULY,BRIAN, ROBINSON,KERRY, HARBOTTLE,ANDREW.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 18 de Abril de 2006.
Fecha Concesión Europea: 13 de Octubre de 2010.
Clasificación PCT:
- A61P35/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Agentes antineoplásicos.
- C12N15/11 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12N15/12 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas animales.
- C12N15/53 C12N 15/00 […] › Oxidorreductasas (1).
- C12Q1/48 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- C40B40/08 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA. › C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas que contienen ARN o ADN que codifican proteínas, p. ej. genotecas.
- G01N33/574 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para el cáncer.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.
Fragmento de la descripción:
Reorganizaciones y mutaciones mitocondriales como herramientas de diagnóstico para la detección de exposición solar, cáncer de próstata y otros cánceres.
Campo técnico de la invención
Esta invención se refiere al campo de la genómica mitocondrial. En particular, se refiere a mutaciones y reorganizaciones en el genoma mitocondrial y su utilidad como indicador de la exposición al sol, el envejecimiento y la génesis o existencia de enfermedades, por ejemplo la detección de la presencia de preneoplasia, neoplasia y progresión hacia tumor maligno potencial antes de que sean evidentes síntomas clínicos comunes.
Antecedentes de la invención
La megatendencia actual en las ciencias biológicas es el proyecto del genoma humano y el aprovechamiento comercial de los datos. Sin embargo, existe una limitación excepcional al uso y aplicación de esta información ya que los datos no son específicos a nivel de individuo. Increíblemente, los datos son de sólo unos pocos individuos, apenas representativos de la variación presente en poblaciones humanas, haciendo que los datos sean útiles solamente en aplicaciones generales. La asombrosa complejidad del genoma humano hace que la aplicación en una base individual sea impráctica. Para secuenciar completamente un genoma nuclear humano el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos han invertido 2,5 mil millones de dólares desde 1988 (http://www.om1.govlhgmis/project/budget.html).
Genoma Mitocondrial
El genoma mitocondrial es una secuencia compacta aunque crítica de ácido nucleico. El genoma mitocondrial codifica subunidades enzimáticas necesarias para la respiración celular. El ADN mitocondrial o "ADNmt" es un genoma minúsculo de ácido nucleico de 16.569 pares de bases (pb) (Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999) al contrario que el inmenso genoma nuclear de 3,3 mil millones de pb. Su dotación genética es astronómicamente más pequeña que la de su compañero celular nuclear (0,0005%). Sin embargo, las células individuales llevan en cualquier parte de 103 a 104 mitocondrias dependiendo de la función celular específica (Singh y Modica-Napolitano 2002). La comunicación o señalización química se produce rutinariamente entre los genomas nuclear y mitocondrial (Sherratt et al., 1997). Además, los componentes nucleares específicos son responsables del mantenimiento e integridad de la secuencia mitocondrial (Croteau et al., 1999). Cuando estas áreas nucleares se vuelven no funcionales por reorganizaciones nucleares indicativas de posible enfermedad, entonces comienzan a aparecer mutaciones en secuencias de ADNmt. Además, pueden identificarse mitocondrias específicas para su destrucción intracelular por deleciones provocadas por mutaciones somáticas en el genoma mitocondrial. Este mecanismo teórico también puede servir como indicio de enfermedad inminente. Son necesarios aproximadamente 3.000 genes para generar una mitocondria, estando sólo treinta y siete de estos codificados por el genoma mitocondrial, indicando una fuerte dependencia mitocondrial de loci nucleares (Naviaux, 1997).
Todos los genomas de ADN mitocondrial (ADNmt) en un individuo dado son idénticos dada la expansión clonal de las mitocondrias dentro del óvulo una vez que se ha producido la fecundación. El papel esencial del ADNmt es la generación del combustible celular, el trifosfato de adenosina (ATP), que dispara el metabolismo celular. Significativamente, el genoma mitocondrial depende de setenta proteínas de codificación nuclear para efectuar las reacciones de oxidación y reducción necesarias para su función vital, además de los trece polipéptidos suministrados por el genoma mitocondrial (Leonard y Shapira, 1997). Diferentes tejidos y órganos dependen de la fosforilación oxidativa en un grado variable. Las enfermedades relacionadas con una fosforilación oxidativa defectuosa (OXPHOS) parecen estar estrechamente relacionadas con mutaciones de ADNmt (Byme, 1992). Por consiguiente, a medida que disminuye la OXPHOS debido a un aumento de la gravedad de mutaciones de ADNmt, se superan los umbrales energéticos específicos de órgano, lo que da origen a una diversidad de fenotipos clínicos. Además, las mutaciones en el genoma mitocondrial están asociadas con una diversidad de enfermedades degenerativas crónicas (Gattermann et al. 1995). Es bien sabido que el envejecimiento y tipos específicos de patologías pueden alterar o mutar el ADNmt, comprometiendo la capacidad de producción de energía de la célula. Esto da como resultado con frecuencia la sobreexpresión de mitocondrias defectuosas y/o que la célula complemente la ausencia de ATP haciéndose más glucolítica (Carew y Huang, 2002); por lo tanto, los cambios o mutaciones en el genoma mitocondrial pueden usarse como marcadores para la génesis de enfermedad y/o la progresión de enfermedad, cuando se controlan a intervalos sucesivos.
Recientemente, Fliss et al. (2000) descubrieron, en tumores primarios de cáncer de pulmón y de vejiga, una alta frecuencia de mutaciones de ADNmt que eran predominantemente homoplásmicas por naturaleza, indicando que el ADNmt mutante era dominante en las células malignas. Las mutaciones y deleciones puntuales parecerían ser el efecto secundario no programado pero inevitable del daño de radicales libres de oxígeno en la membrana y el genoma de las mitocondrias (Miquel et al. 1992). Esta teoría es plausible porque, no sólo el genoma mitocondrial está carente de histonas protectoras, sino que también es vulnerable al daño oxidativo que se encuentra cerca de la membrana mitocondrial interna generadora de oxígeno. Además, como el ADNmt tiene un genoma compacto y carece de intrones, es probable por lo tanto que los acontecimientos perjudiciales afecten a una secuencia codificante dando como resultado una disfunción bioquímica. Esta disfunción aumentará adicionalmente el estrés oxidativo celular, lo que conducirá a daño nuclear así como del ADNmt, aumentando de este modo el potencial de que una célula entre en el proceso canceroso (Penta et al., 2001). A este respecto, la investigación indica que con el aumento de la edad existe un aumento en el daño del ADNmt (Cortopassi y Wang 1995) y una disminución posterior de la función respiratoria (Miquel et al. 1992), conduciendo a una muerte celular final.
Petros et al., PNAS, volumen 102, páginas 719-724, han descrito que la disfunción mitocondrial causada por mutaciones/deleciones se correlaciona con la aparición del carcinoma de próstata. En la columna derecha de la página 723, se considera que las mutaciones de ADNmt desempeñan un papel importante en la etiología al cáncer de próstata. El cáncer se califica incluso de "enfermedad mitocondrial". En Cormier-Daire, Journal of Pediatrics, volumen 124, páginas 63-70, los autores han descubierto que dicha deleción (deleción de 3379 pb que comprende los genes principales del complejo respiratorio de complejo I, ND4L, ND4, ND5, así como 3 genes de ribonucleasa de transferencia (ARNt para His, Ser y Leu)), consúltese la columna derecha de la página 66, estará correlacionada/asociada con diarrea crónica y atrofia de las vellosidades en niños.
ADNmt como Herramienta de Diagnóstico
Las dinámicas de secuencias de ADNmt son herramientas de diagnóstico importantes. Las mutaciones en el ADNmt son con frecuencia indicadores preliminares de enfermedades en desarrollo, a menudo asociadas con mutaciones nucleares, y actúan como biomarcadores específicamente relacionados con enfermedades, tales como, pero sin limitación: daño tisular y cáncer por tabaquismo y exposición indirecta al humo del tabaco (Lee et al., 1998; Wei, 1998); longevidad, basada en la acumulación de mutaciones en el genoma mitocondrial que comienzan aproximadamente a los 20 años de edad y aumentan a partir de entonces (von Wurmb, 1998); enfermedad metastásica causada por mutación o exposición a carcinógenos, mutágenos, radiación ultravioleta (Birch-Machin, 2000); artrosis; enfermedad cardiovascular, Alzheimer, Parkinson (Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997; Zhang et al, 1998); pérdida auditiva asociada con la edad (Seidman et al., 1997); degeneración del nervio óptico y arritmia cardíaca (Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988); exoftalmoplejía externa progresiva crónica (Taniike et al., 1992); aterosclerosis (Bogliolo et al., 1999); carcinomas tiroideos papilares y tumores tiroideos (Yeh et al., 2000); así como...
Reivindicaciones:
1. Un método de detección de una deleción que abarca aproximadamente los nucleótidos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt humano, en el que dicha deleción está asociada con cáncer de próstata, en un sujeto que tiene ADNmt, que comprende:
2. El método de la reivindicación 1, en el que la deleción es de aproximadamente 3379 pb.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la deleción comprende sustancialmente genes que codifican la subunidad 4L de la NADH deshidrogenasa, la subunidad 4 de la NADH deshidrogenasa, la subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa, el ARNt de histidina, el ARNt de serina 2 y el ARNt de leucina 2.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de detectar la presencia de la deleción en el ADNmt comprende un análisis de PCR seleccionado del grupo que consiste en análisis de PCR específico de deleción, análisis de PCR radiactiva, análisis de PCR cuantitativa y PCR a tiempo real.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el análisis de PCR es PCR cuantitativa que comprende el uso de una ADN polimerasa Taq termoestable recombinante.
6. Uso de una matriz para diagnosticar el cáncer de próstata, comprendiendo la matriz una pluralidad de elementos de ácido nucleico y un sustrato sólido, en la que uno de los elementos de ácido nucleico está asociado con una deleción en aproximadamente los nucleótidos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt humano, en la que el elemento de ácido nucleico tiene una posición única en dicha matriz y se asocia de forma estable con el sustrato sólido.
7. Uso de una deleción de ADNmt que abarca aproximadamente los nucleótidos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt humano como biomarcador para el cáncer de próstata.
8. El uso de la reivindicación 7, en el que la deleción es de aproximadamente 3379 pb.
9. El uso de la reivindicación 7, en el que la deleción se detecta en tejido maligno, tejido benigno adyacente, tejido benigno distante, lesiones precursoras, fluido de masaje de próstata, orina, orina post-DRE o sangre, en un sujeto que tiene cáncer de próstata o con progresión hacia cáncer de próstata, o un sujeto sin cáncer de próstata.
10. Un método para el mapeo tridimensional del tumor de próstata, que comprende:
11. Uso de un kit para detectar una deleción de ADNmt asociada con cáncer de próstata, comprendiendo el kit una matriz que incluye un elemento de ácido nucleico asociado con una deleción en aproximadamente los nucleótidos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt humano, y al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: una microplaca desechable, medios para sujetar la microplaca desechable, medios para la extracción de ADNmt, cebadores, reactivos e instrucciones.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se usa un cebador de PCR que tiene una secuencia correspondiente a la SEC ID Nº: 139 como cebador directo.
13. El método de la reivindicación 1, en el que el método se usa para detectar cáncer de próstata, una predisposición a cáncer de próstata o la progresión del cáncer de próstata.
14. Uso de un kit para detectar una deleción de ADNmt asociada con cáncer de próstata, comprendiendo el kit:
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