RECEPTOR APO-2.

[0001] La presente invención se refiere en general a los anticuerpos anti-polipéptido Apo-2 para utilizar en métodos de tratamiento médico.. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Apoptosis o Muerte celular programada [0002] Se cree que el control del número de células en mamíferos viene determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, a la que a veces se hace referencia como muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como una forma patológica de muerte celular causada por algún traumatismo o lesión celular. En cambio, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que habitualmente se produce de una forma ordenada o controlada. A menudo se hace referencia a esta forma de muerte celular ordenada o controlada como "apoptosis" [véase, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12: 487-493 (1994); Steller et al., Science, 267: 1445-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica tiene lugar de forma natural en muchos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario y la selección clonal en el sistema inmunitario [Itoh et al., Cell, 66: 233-243 (1991)]. Los índices bajos de muerte celular apoptótica se han asociado con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo cáncer, lupus e infección con virus del herpes [Thompson, Science, 267: 1.456- 1.462 (1995)]. Los índices elevados de muerte celular apoptótica pueden estar asociados con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, daño por repercusión, enfermedad hepática inducida por toxinas [véase, Thompson, supra.]. [0003] La muerte celular apoptótica habitualmente se acompaña de uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en células, tales como la condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades en la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Se cree que hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que desencadenan o inducen tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356: 397-400 (1992); Steller, supra; Sachs et al., Blood, 82: 15 (1993)]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la eliminación de determinados factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356: 314-317 (1992)]. Además, se ha descrito que algunos de oncogenes identificados tales como myc, rel y E1A, y de supresores tumorales, como p53, tienen un papel en la inducción de la apoptosis. Asimismo, se ha observado que algunos fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de apoptosis [Thompson, supra]. Familia TNF de citoquinas [0004] Varias moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral ("TNF-"), el factor de necrosis tumoral ß ("TNFß" o "linfotoxina"), el ligando CD30, el ligando CD27 , el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 (al que también se hace referencia como ligando Fas o ligando CD95), y el ligando Apo-2 (al que también se hace referencia como TRAIL) se han identificado como miembros de la familia de las citoquinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85: 3.378-3.404 (1995); Wiley et al, Immunity, 3: 673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996); WO 97/01633, publicada el 16 de enero de 1997]. Entre estas moléculas, se ha descrito que el TNF-, el TNF-ß, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 y el ligando Apo-2 (TRAIL) están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que tanto el TNF- como el TNF-ß inducen muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad, Sci., 83: 1981 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)]. Zheng et al. han descrito que el TNF- está implicado en la apoptosis posterior a la estimulación de células T CD8-positivas [Zheng et al., Nature, 377: 348-351 (1995)]. Otros investigadores han descrito que el ligando CD30 puede estar implicado en la deleción de células T autorreactivas en el timo [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. N.º 10, (1995)]. [0005] Las mutaciones en el receptor de ratón Fas/Apo-1 o en los genes del ligando (denominados lpr y gld, respectivamente) se han relacionado con algunos trastornos autoinmunitarios, lo que indica que el ligando Apo-1 puede desempeñar algún papel en la regulación de la deleción clonal de linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267: 1.449-1.456 (1995)]. También se ha descrito que el ligando Apo-1 induce la apoptosis posterior a la estimulación en linfocitos T CD4-positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales de ratón agonistas que se unen específicamente al receptor Apo-1 muestran actividad citotóxica que es comparable o similar a la del 2   TNF- [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1.747-1.756 (1989)]. Familia de receptores de TNF [0006] Se cree que la inducción de las diversas respuestas celulares mediadas por dichas citoquinas de la familia de TNF es iniciada por su unión con receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNF-R1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14.927- 14.934 (1989); Brockhaus et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3.127-3.131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991], y se han aislado y caracterizado los ADNc humanos y de ratón correspondientes a ambos tipos de receptores [Loetscher et al., Cell, 61: 351 (1990); Schall et al., Cell, 61: 361 (1990); Smith et al., Science, 248: 1.019- 1.023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2.830-2.834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell, Biol., 11: 3.020- 3.026 (1991)]. Se han asociado polimorfismos extensos con ambos genes de receptores de TNF [véase, por ejemplo, Takao et al., Immunogenetics, 37: 199-203 (1993)]. Ambos TNFRs comparten la estructura típica de los receptores de superficie celular incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores también se encentran de forma natural como proteínas de unión a TNF solubles [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8331 (1990)]. La clonación de receptores de TNF solubles recombinantes fue descrita por Hale et al. [J. Cell. Biochem. Suplemento 25 F, 1991, página 113 (P424)]. [0007] La parte extracelular de TNFRs de tipo 1 y de tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón de secuencia de aminoácidos repetitivo de cuatro dominios ricos en cisteína (CRDs) designado de 1 a 4, empezando desde el extremo NH2. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y contiene de 4 a 6 residuos de cisteína en las posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRDs son los siguientes: CRD1 aminoácidos 14 hasta aproximadamente 53; CRD 2 aminoácidos desde aproximadamente 54 hasta aproximadamente 97; CRD3 - aminoácidos desde aproximadamente 98 hasta aproximadamente 138; CRD4 - aminoácidos desde aproximadamente 139 hasta aproximadamente 167. En TNFR2, CRD1 incluye los aminoácidos 17 hasta aproximadamente 54; CRD 2 aminoácidos desde aproximadamente 55 hasta aproximadamente 97; CRD 3 aminoácidos desde aproximadamente 98 hasta aproximadamente 140; y CRD 4 aminoácidos desde aproximadamente 141 hasta aproximadamente 179 (Banner et al., Cell, 73: 431-435 (1993)]. El papel potencial de los CRDs en la unión de ligando también está descrito por Banner et al., supra. [0008] Existe un patrón repetitivo similar de CRDs en otras proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47: 545 (1986); Radeke et al., Nature, 325: 593 (1987)], el antígeno CD40 de células B [Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403 (1989)], el antígeno OX40 de células T [Mallet et al., EMBO J., 9: 1063 (1990)] y el antígeno de Fas [Yonehara et al., supra e Itoh et al., supra]. Los CRDs también se hallan en las proteínas T2 de tipo TNFR (TNFRs) solubles de los virus de Shope y poxvirus de mixoma [Upton et al., Virology, 160: 20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res.... [Seguir leyendo]

1.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento, en el que el anticuerpo (a) se une al polipéptido Apo-2 que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 411 de la SEC ID No: 1 y (b) induce la apoptosis en por lo menos un tipo de células cancerosas de mamífero in vivo o ex vivo que expresa dicho polipéptido Apo-2. 2.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según la reivindicación 1, que se une a una secuencia de dominio extracelular de un polipéptido Apo-2 que consiste en los aminoácidos 54 a 182 de la SEC ID No: 1. 3.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según la reivindicación 1, que se une a una secuencia de dominio extracelular de un polipéptido Apo-2 que consiste en los aminoácidos 1 a 182 de la SEC ID No: 1. 4.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según la reivindicación 1 que (a) se une a la secuencia del dominio extracelular del polipéptido Apo-2 que consiste en los aminoácidos 54 a 182 de la SEC ID No: 1 y (b) induce la apoptosis en por lo menos un tipo de células cancerosas de mamífero in vivo o ex vivo. 5.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico. 6.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga. 7.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado. 8.- Anticuerpo monoclonal para utilizar en un método de tratamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano. 62   Figura 1A 63   Figura 1B 64   Figura 1C Figura 2A Figura 2B   Figura 4A Níquel 66 Figura 3 Figura 4B   Porcentaje de apoptosis Porcentaje de apoptosis Sonda no marcada Sonda marcada Figura 4C Inmunoadhesina (nM) Figura 4E Porcentaje de apoptosis Porcentaje de apoptosis 67 Figura 4D Tampón Tampón Figura 5C   Sonda no marcada Sonda marcada Riñón Higado Pulmón Cerebro Fetal Tampón LÍNEA DE CÉLULAS CANCEROSAS Tampón 68 Adulto Figura 5B Figura 6B Figura 5A PBL Colon Intestino d. Ovario Testículos Próstata Timo Bazo Páncreas Riñón Músculo e. Hígado Pulmón Placenta Cerebro corazón Figura 6A   RECUENTOS % de APOPTOSIS COMPARADO CON Apo2L Figura 8 Figura 7 CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPOS 69   % de APOPTOSIS COMPARADO CON Apo2L (1 µg) Figura 9 % de APOPTOSIS DE CÉLULAS 9D Figura 10 ANTICUERPO AUSENCIA DE Fc DE IgG DE CABRA ANTI-RATÓN PRESENCIA DE Fc DE IgG DE CABRA ANTI-RATÓN NINGUNO   DO 450/620 Figura 11 CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPOS 71   DILUCIÓN Figura 12A 72   DILUCIÓN Figura 12B 73   DILUCIÓN Figura 12C 74     Figura 13B DO 540 nm Figura 13C CPM (BASE RESTADA) Solo scFv SÓLO CÉLULAS SÓLO CÉLULAS Solo scFv 76   77   20E6 VIOLETA CRISTAL CPM (BASE RESTADA) DO 540 nm 20E6 ANEXINA V 78 CONCENTRACIÓN (µg/ml) Figura 14B   DO 540 nm 79 Figura 14C   Figura 15A Figura 15B   Figura 15C 81   82