REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA CON ARRANQUE EN CALIENTE POR SECUESTRO DE MAGNESIO.

Péptido sintético seleccionado entre el grupo que consiste en H-DIET-NH2 H-DIETDIET-NH2 H-DIETDIETDIET-NH2 y H-FDGDFDGD-NH2

Sector técnico

La presente invención se refiere al sector técnico de la amplificación de ácidos nucleicos llevando a cabo el proceso de reacción de la cadena de polimerasa (PCR). De manera más precisa, la presente invención da a conocer una nueva alternativa de arranque en caliente “hot start” para llevar a cabo PCR, que permite eventos de cebado no específicos y la generación de falsos productos de amplificación.

Técnica anterior

Un problema importante con la amplificación de ácido nucleico y de manera más específica con la reacción PCR es la generación de productos de amplificación no específicos. En muchos casos esto es debido al cebado no específico de oligonucleotidos y a un evento de extensión del cebador antes del propio proceso de termociclado real, dado que las polimerasas de ADN termoestables son también moderadamente activas a temperatura ambiente. Por ejemplo, se observan frecuentemente productos de amplificación debidos a dimerización y subsiguiente extensión que ha tenido lugar eventualmente al azar. A efectos de superar este problema es bien conocido en la técnica llevar a cabo una PCR llamada “arranque en caliente” (“hot start”), en la que se separa de la mezcla de reacción o se mantiene en estado inactivo un componente esencial para la reacción de amplificación hasta que la temperatura de la mezcla de reacción aumenta por primera vez. Dado que la polimerasa no puede funcionar en estas condiciones, no hay alargamiento del cebador durante este periodo cuando los cebadores no se pueden unir específicamente. Para conseguir este efecto se han aplicado varios métodos:

a) Separación física de ADN polimerasa

La separación física puede ser obtenida, por ejemplo, por una barrera de cera sólida, que separa el compartimiento que contiene el ADN polimerasa con respecto al compartimiento que contiene el volumen de los otros reactivos. Durante la primera etapa de calentamiento la cera se funde automáticamente y los compartimientos fluidos se mezclan (Chou, Q. y otros Nucleic Acids Res 20 (1992) 1717-23, US 5.411.876). De manera alternativa, el ADN polimerasa es inmovilizada por afinidad sobre un soporte sólido antes de la reacción de amplificación y se libera solamente a la mezcla de reacción por una liberación mediada por calor (Nilsson, J. y otros Biotechniques 22 (1997) 744-51). No obstante, ambos métodos son engorrosos en cuanto a tiempo y difíciles de realizar.

b) Modificación química de ADN polimerasa

Para este tipo de PCR de arranque en caliente el ADN polimerasa es inactivada de manera reversible como resultado de una modificación química. De manera más precisa, se introducen grupos de bloqueo lábiles al calor en la Taq (US 5.773.258) ADN polimerasa que hace la enzima inactiva a temperatura ambiente. Estos grupos de bloqueo son eliminados a alta temperatura durante una etapa pre-PCR de manera tal que la enzima resulta activada. Esta modificación lábil al calor puede ser obtenida, por ejemplo, por acoplamiento de anhídrido citracónico o anhídrido aconítrico a los residuos de lisina de la enzima. Las enzimas que llevan a cabo estas modificaciones se encuentran a disposición comercialmente con las designaciones Amplitaq Gold (Moretti, T. y otros Biotechniques 25 (1998) 716-22) o FastStart ADN polimerasa (Roche Molecular Bichemicals). No obstante, la introducción de grupos bloqueantes es una reacción química que tiene lugar arbitrariamente en todos los residuos estéricamente disponibles de lisina de la enzima. Por lo tanto, la reproductibilidad y la calidad de los preparados de enzimas, modificadas químicamente, pueden variar y difícilmente se pueden controlar.

c) Modificación recombinante de ADN polimerasa

Se han preparado por medio de ingeniería genética mutantes sensibles al frío de Taq polimerasa. Estos mutantes difieren de la enzima natural por el hecho de que carecen del terminal N (US 6.241.557). En contraste con Taq polimerasa recombinante de tipo nativo o salvaje, estos mutantes son completamente inactivos por debajo de 35º C, y, por lo tanto, pueden ser utilizados en algunos casos para llevar a cabo una PCR de arranque en caliente. No obstante, el mutante sensible al frío con terminal N truncado requiere condiciones de tampón de bajo contenido salino, tiene una capacidad de proceso más baja en comparación con la enzima de tipo salvaje, y por lo tanto puede ser utilizado solamente para la amplificación de ácidos nucleicos objetivo cortos. Además, dado que la forma truncada carece de actividad 5'-3' exonucleasa, no puede ser utilizada para experimentos de PCR en tiempo real, basados en el formato de detección TacMan.

d) Inhibición de ADN polimerasa por aditivos de ácido nucleico

Se ha demostrado que la extensión de cebadores no específicamente equilibrados es inhibida por la adición de fragmentos cortos de ADN de doble hebra (Kainz, P. y otros Biotechiniques 28 (2000) 278-82). En este caso, la extensión del cebador es inhibida a temperaturas por debajo del punto de fusión del fragmento de ADN de doble hebra corto, pero de manera independiente de la secuencia del propio ADN competidos. No obstante, no es conocido hasta que medida el exceso de ADN competidor influye en el rendimiento de la reacción de amplificación del ácido nucleico.

De manera alternativa, se pueden utilizar Aptameros oligonucleotidos con una secuencia específica que resultan en una estructura secundaria definida. Estos aptameros han sido seleccionados utilizado tecnología SELEX para conseguir una afinidad muy elevada con respecto a el ADN polimerasa (5.693.502 ,Lin, Y. Jayasema, S. D. Mol Biol 271 (1997) 100-11). La presencia de dichos aptameros dentro de la estructura de amplificación antes del propio proceso de termociclado real tiene como resultado también una unión de alta afinidad a el ADN polimerasa, y, como consecuencia, una inhibición lábil térmicamente de su actividad (US 6.020.130). No obstante, debido al proceso de selección, todos los aptameros disponibles hasta el momento pueden ser utilizados solamente en combinación con una especie particular de ADN polimerasa.

e) Anticuerpos Taq ADN

En un enfoque alternativo para conseguir la inhibición térmicamente lábil de Taq ADN polimerasa es la adición de anticuerpos monoclonales criados contra la enzima purificada (Kellogg, D. E. y otros Biotechniques 16 (1994) 11347; Sharkey, D. J, y otros Biotechnology (N Y) 12 (1994) 506-9). Igual que los aptameros oligonucleotidos, el anticuerpo se une a Taq ADN polimerasa con elevada afinidad a temperatura ambiente de manera inhibitoria (US 5.338.671). El complejo es resuelto en una etapa de precalentamiento antes del propio procedimiento de termiciclado. Esto conduce a una sustancial prolongación del tiempo necesario para la amplificación en su conjunto, especialmente si se aplican protocolos para termociclado rápido (WO 97/46706).

El documento US 5.985.619 da a conocer una realización específica para llevar a cabo PCR utilizando un anticuerpo de arranque en caliente, en el que además de Taq polimerasa se añade, por ejemplo, exonucleasa III procedente de

E. coli como suplemento a la mezcla de amplificación a efectos de digerir intermedios dímeros cebadores no específicos. Tal como se ha dado a conocer en lo anterior, la exonucleasa III reconoce ADN de doble hebra como sustrato igual que, por ejemplo, productos híbridos de extensión diana/cebador-o diana/cebador. La digestión tiene lugar por medio de fraccionamiento del enlace de fosfodiéster en el extremo 5' del residuo de desoxinucleotido del terminal 3'. Dado que este tipo de exonucleasa es activa a temperaturas ambiente, todos los cebadores no específicamente asociados y productos de extensión de cebadores son, por lo tanto, digeridos. Esto tiene como resultado en algunas realizaciones una especificidad, incluso incrementada, de la reacción de amplificación. No obstante, la digestión de los cebadores no especificados, dependientes de la duración del tiempo de preincubación, puede conducir a una disminución sustancial e incontrolada de la concentración del cebador, que a su vez puede afectar la propia reacción de amplificación.

f) Utilización de cebadores modificados solos o en combinación con exonucleasas

Los documentos EP 0 799 888 y GB 2293238 dan a conocer una adición de oligoniucleotidos bloqueados en 3' a reacciones PCR. Debido al bloqueo 3', estos oligonucleotidos no pueden actuar como cebadores. Los oligonucleotidos bloqueados están diseñados para competir/interaccionar... [Seguir leyendo]

1. Péptido sintético seleccionado entre el grupo que consiste en H-DIET-NH2 H-DIETDIET-NH2 H-DIETDIETDIET-NH2 y H-FDGDFDGD-NH2.

2. Composición que comprende -una DNA polimerasa termoestable -como mínimo un tipo de catión bivalente, preferentemente Mg2+ -desoxinuleótidos -un tampón -un péptido sintético que tiene una longitud no superior a 30 aminoácidos comprendiendo un lugar de unión de catión bivalente.

3. Composición, según la reivindicación 2, que comprende además, como mínimo, un compuesto de ácido nucleico.

4. Kid que comprende -un péptido sintético que tiene una longitud no superior a 30 aminoácidos, comprendiendo un lugar de unión de catión bivalente -un ADN polimerasa termoestable.

5. Método para la amplificación de un ácido nucleico diana específico que comprende las siguientes etapas: -disponer una muestra que se sospecha que contiene dicho ácido nucleico diana -añadir una composición, según las reivindicaciones 2-3 -llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico.

6. Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción de cadena de polimerasa que es monitorizada en tiempo real.

7. Método, según las reivindicaciones 5-6, caracterizado porque el producto de amplificación generado por dicha amplificación es sometido a análisis de curva de fusión.