QUINONAS COMO MEDIADORES DE ENSAYOS FOTOMÉTRICOS.

Procedimiento para la detección óptica de un analito de una muestra,

que consta de los pasos siguientes: (a) poner en contacto la muestra con un reactivo de detección, formado por una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, una coenzima de nicotinamida reducible, un mediador, que es una quinona y un indicador óptico reducible o un sistema de indicador óptico reducible; dicho analito se oxida con una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, se reduce la coenzima de nicotinamida y se transfieren los electrones de la coenzima de nicotinamida reducida a través del mediador al indicador óptico o al sistema de indicador óptico y (b) determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra mediante la detección óptica del indicador o del sistema de indicador, dicha oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida es una alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), una glucosa-deshidro-genasa (EC 1.1.1.47) o una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), el indicador óptico es un heteropoliácido y el mediador es una 1,10-fenantrolinaquinona, una 1,7-fenantrolinaquinona, una 4,7fenantrolinaquinona o una sal N-alquilada o N,N'-dialquilada de las mismas

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección óptica de un analito de una muestra, un reactivo de detección idóneo para este fin, kits y elementos de ensayo.

Los sistemas de medición de la analítica bioquímica constituyen componentes importantes de procedimientos analíticos clínicamente importantes. Ocupa un lugar predominante la medición de analitos, que pueden determinarse directa o indirectamente mediante enzimas. Los analitos se transforman para ello mediante un complejo de enzimacoenzima y después se cuantifica, empleando opcionalmente reactivos adicionales. Para ello se pone en contacto el analito a determinar con una enzima apropiada y una coenzima, empleando la enzima por lo general en una cantidad catalíticamente suficiente. La coenzima se modifica con la reacción enzimática, p.ej. se oxida o se reduce. Este proceso puede detectarse directa o indirectamente, por medios electroquímicos y/o fotométricos. Gracias al calibrado se consigue establecer una relación directa entre el valor medio y la concentración del analito a determinar.

Sin embargo, los procesos analíticos ya conocidos por el estado de la técnica adolecen de ciertos inconvenientes. Por ejemplo, recurren a numerosas tiras analíticas, que permiten la detección fotométrica del analito, este es un sistema de detección, en el que se emplea como enzima la glucosa-colorante-oxidorreductasa (GlucDOR; EC 1.1.5.2), una glucosa-deshidrogenasa dependiente de la PQQ. Al mismo tiempo que, en el marco de la reacción enzimática, se oxida el sustrato, tiene lugar una reducción simultánea de la coenzima correspondiente. En el caso de la coenzima PQQ (PQQ: pirroloquinolinaquinona; ácido 4,5-dihidro-4,5-dioxo-1H-pirrolo[2,3-f]-quinolina-2,7,9-tricarboxílico) tiene lugar una reducción que conduce a la PQQH2, que, a su vez, puede ceder electrones a un indicador óptico reducible. El inconveniente de este sistema estriba en la escasa especificidad de la glucosa-colorante-oxidorreductasa, que además de la glucosa hace reaccionar también a otros sacáridos, por ejemplo la maltosa y la galactosa y, debido a la reacción secundaria, puede arrojar resultados ligeramente falseados.

La glucosa-deshidrogenasa dependiente de la NAD+ (EC 1.1.1.47) es una enzima, que en presencia de la coenzima dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD+) cataliza la oxidación de la glucosa a la glucono-δ-lactona y posee una especificidad claramente superior para la glucosa que para la glucosa-colorante-oxidorreductasa. Por ejemplo, en el ensayo en cubeta (o en ensayos de química húmeda o en solución), la glucosa-deshidrogenasa provoca la reacción de la glucosa y además de la xilosa y manosa, pero solamente en un 15% y un 8%, respectivamente, mientras que la galactosa y la fructosa no constituyen sustratos apropiados para la enzima (Tietz Textbook of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Company, 2ª edición, 1994, coordinadores: C.A. Burtis, E.R. Ashwood, páginas 964-965).

El NADH formado en el marco de la oxidación de la glucosa con glucosa-deshidrogenasa y posterior reducción de la NAD+, tiene una reactividad escasa y no reacciona directamente con indicadores ópticos reducibles, por ejemplo el ácido molibdatofosfórico o las 4-nitrosoanilinas. Para contrarrestar esta lentitud de reacción del NADH se emplean en la práctica mediadores que aumentan la reactividad de la coenzima. Como mediadores se conocen ya por ejemplo la diaforasa (EC 1.6.99.2) o el metosulfato de N-metil-fenazonio inestable.

En EP 0 831 327 A1 se describe el uso de compuestos activos en reacciones redox para la fabricación de reactivos de detección en un procedimiento de determinación de un analito, así como kits de reactivos, que contienen estos compuestos activos en reacciones redox. Como compuestos activos en reacciones redox se describen en este contexto los compuestos con subestructura de benzoquinoxalinadiona, que entre otros pueden utilizarse también como mediadores para aplicaciones colorimétricas y electroquímicas.

En EP 1 566 637 A1 se describen elementos de ensayo y procedimientos para la detección óptica de analitos, dichos elementos de ensayo constan de un soporte por lo menos en parte ópticamente en alto grado transparente y una película monocapa reactiva, que contiene un reactivo para la determinación del analito, dicha película tiene un grosor de ≤ 10 μm. El reactivo comprende por lo menos una enzima y por lo menos un sustrato enzimático que puede detectarse directa o indirectamente después de la reacción enzimática.

En WO 99/19507 se describe el uso de compuestos de fenantrolinaquinona como mediadores en el marco de la detección amperométrica de analitos. Para ello se deposita una muestra, en la que se quiere detectar la presencia de un analito, sobre una tira analítica electroquímica, que consta de un soporte, un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia/contraelectrodo así como elementos conductores, se oxida el analito con una enzima dependiente de la nicotinamida en presencia de una coenzima de la nicotinamida y del mediador y se mide la corriente requerida para la reoxidación del mediador reducido, dicha corriente guarda relación con la concentración del analito.

En WO 2004/038401 A2 se describen biosensores para la detección amperométrica de la concentración de analitos, por ejemplo glucosa, 3-hidroxibutirato y lactato, de una muestra empleando tiras analíticas electroquímicas, descritas en WO 99/19507. Como mediador se emplea la 1,10-fenantrolina-5,6-quinona, que para proteger contra el oxígeno se combina con iones de metales de transición (p.ej. manganeso, hierro, osmio, etc.) o iones de metales alcalinotérreos pesados (p.ej. calcio, bario, etc.).

El inconveniente de los procedimientos descritos en WO 99/19507 y WO 2004/038401 A2 estriba en el uso de elementos analíticos electroquímicos, que, en el marco de una detección cualitativa o cuantitativa del analito, no permiten la comprobación visual de la verosimilitud de los resultados obtenidos en la medición por cotejo con los colores de referencia.

El objeto de la invención consiste, pues, en desarrollar un procedimiento de detección de analitos de una muestra, que permita una ejecución sencilla y económica y al mismo tiempo una gran selectividad y seguridad de medición.

Este objeto se consigue según la invención con un procedimiento de detección óptica de un analito de una muestra, que consta de los pasos siguientes:

a) poner en contacto la muestra con un reactivo de detección, formado por una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, una coenzima de nicotinamida reducible, un mediador, que es una quinona y un indicador óptico reducible o un sistema de indicador óptico reducible, dicho analito se oxida con una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, se reduce la coenzima de nicotinamida y se transfieren los electrones de la coenzima de nicotinamida reducida a través del mediador al indicador óptico o al sistema de indicador óptico y

b) determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra mediante la detección óptica del indicador

o del sistema de indicador,

dicha oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida es una alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), una glucosadeshidro-genasa (EC 1.1.1.47) o una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), el indicador óptico es un heteropoliácido y el mediador es una 1,10-fenantrolinaquinona, una 1,7-fenantrolinaquinona, una 4,7fenantrolinaquinona o una sal N-alquilada o N,N'-dialquilada de las mismas.

El procedimiento de la invención sirve para la detección óptica de un analito de una muestra, que puede proceder de cualquier tipo de fuente. En una forma preferida de ejecución la muestra procede de un fluido corporal, que incluye, pero no se limita a: la sangre total, el plasma, el suero, el líquido linfático, el líquido biliar, el líquido cerebroespinal, la orina, así como los líquidos segregados por glándulas, por ejemplo la saliva o el sudor, siendo especialmente preferidos la sangre total, el plasma y el suero. La cantidad de muestra requerida para la realización de los análisis se sitúa por lo general entre 0,01 μl y 100 μl, con preferencia entre 0,1 μl y 2 μl.

El analito a determinar por métodos cualitativos y cuantitativos es una sustancia biológica o química, que pueda detectarse en una reacción redox. El analito se elige con preferencia entre el grupo formado por el alcohol y la glucosa. En otra forma especialmente preferida de ejecución, el analito a determinar... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección óptica de un analito de una muestra, que consta de los pasos siguientes:

(a) poner en contacto la muestra con un reactivo de detección, formado por una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, una coenzima de nicotinamida reducible, un mediador, que es una quinona y un indicador óptico reducible o un sistema de indicador óptico reducible; dicho analito se oxida con una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, se reduce la coenzima de nicotinamida y se transfieren los electrones de la coenzima de nicotinamida reducida a través del mediador al indicador óptico o al sistema de indicador óptico y

(b) determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra mediante la detección óptica del indicador

o del sistema de indicador,

dicha oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida es una alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), una glucosa-deshidro-genasa (EC 1.1.1.47) o una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), el indicador óptico es un heteropoliácido y el mediador es una 1,10-fenantrolinaquinona, una 1,7-fenantrolinaquinona, una 4,7fenantrolinaquinona o una sal N-alquilada o N,N'-dialquilada de las mismas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es un fluido corporal.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el fluido corporal es la sangre total, el plasma o el suero.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque el analito es alcohol o glucosa.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque la oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida es la glucosa-deshidrogenasa (EC 1.1.1.47).

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque la coenzima de la nicotinamida es la NAD(P)+.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque el mediador es una 1,10fenantrolina-5,6-quinona de la fórmula general (I), una 1,7-fenantrolina-5,6-quinona de la fórmula general (II) o una 4,7fenantrolina-5,6-quinona de la fórmula general (III),

**(Ver fórmula)**

en las que

de R2 a R7 con independencia entre sí significan H, halógeno, OH, O(alquilo), OCO(alquilo), S(alquilo), NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, [N(alquilo)3]+, CN, NO2, COOH, SO3H, o un resto alquilo lineal o ramificado, un resto cicloalquilo, un resto arilo o un resto heteroarilo, que pueden estar eventualmente sustituidos una o varias veces, y

R1 y R8 con independencia entre sí significan un par de electrones libres, H o un resto alquilo lineal o ramificado, que puede estar eventualmente sustituido una o varias veces, o una sal del mismo.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque el mediador es la N-metil1,10-fenantrolinio-5,6-quinona, N,N'-dimetil-1,10-fenantrolinio-5,6-quinona, N-metil-1,7-fenantrolinio-5,6-quinona, N,N'dimetil-1,7-fenantrolinio-5,6-quinona, N-metil-4,7-fenantrolinio-5,6-quinona o N,N'-dimetil-4,7-fenantrolinio-5,6-quinona.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado porque el indicador óptico es el ácido molibdatofosfórico.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 9, caracterizado porque el se realiza sobre un sustrato, dicho sustrato consta de:

(a) una zona de aplicación en la que se deposita la muestra,

(b) una zona de reacción para que el analito reaccione con el reactivo de detección,

(c) una zona de detección para determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra mediante la detección óptica del indicador o del sistema de indicador y

(d) eventualmente una zona de desechos.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la muestra se deposita directamente en la zona de aplicación.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la muestra se recoge mediante un elemento de transferencia y después, eventualmente con humidificación, se deposita en la zona de aplicación.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 10 a 12, caracterizado porque el sustrato es un elemento de ensayo.

14. Reactivo para la detección óptica de un analito de una muestra, que consta de:

(a) una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida,

(b) una coenzima de la nicotinamida reducible,

(c) un mediador, que es una quinona, y

(d) un indicador óptico reducible o un sistema de indicador óptico reducible,

dicha oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida es la alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), glucosadeshidrogenasa (EC 1.1.1.47) o glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), el indicador óptico es un heteropoliácido y el mediador es una 1,10-fenantrolinaquinona, una 1,7-fenantrolinaquinona, una 4,7fenantrolinaquinona, o una sal N-alquilada o una sal N,N'-dialquilada de las mismas.

15. Uso de un reactivo de detección según la reivindicación 14 en un elemento de ensayo.

16. Kit, formado por un reactivo de detección según la reivindicación 14 y un elemento de ensayo, para la detección óptica de un analito de una muestra, dicho elemento de ensayo consta de:

(a) una zona de aplicación en la que se deposita la muestra,

(b) una zona de reacción para que el analito reaccione con el reactivo de detección,

(c) una zona de detección para determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra mediante la detección óptica del indicador o del sistema de indicador y

(d) eventualmente una zona de desechos.

17. Elemento de ensayo para la determinación óptica de un analito de una muestra, que consta de:

(a) una zona de aplicación en la que se deposita la muestra,

(b) una zona de reacción que contiene un reactivo de detección, formado por una oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida, una coenzima de nicotinamida reducible, que es una quinona, y un indicador óptico reducible o un sistema de indicador óptico reducible, para que el analito reaccione con el reactivo de detección,

(c) una zona de detección para determinar la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra mediante la detección óptica del indicador o del sistema de indicador y

(d) eventualmente una zona de desechos,

dicha oxidorreductasa dependiente de la nicotinamida es la alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), glucosadeshidrogenasa (EC 1.1.1.47) o glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), el indicador óptico es un heteropoliácido y el mediador es una 1,10-fenantrolinaquinona, una 1,7-fenantrolinaquinona, una 4,7fenantrolinaquinona, o una sal N-alquilada o una sal N,N'-dialquilada de las mismas.