PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN TACI-FC EMPLEANDO LA TECNOLOGÍA DE CUERPOS GRASOS.

Un método para purificar una proteína TACI-Fc, que comprende las etapas de:

a) mezclar una solución que comprende cuerpos grasos asociados a una proteína A con una muestra que comprende dicha proteína TACI-Fc a fin de obtener una relación final en mg de proteína TACI-Fc por mg de peso seco de cuerpos grasos, dentro de un intervalo desde 1 hasta de 5,5; y b) separar dichos cuerpos grasos con proteína A de dicha proteína TACI-Fc añadiendo una solución acuosa que tiene un pH comprendido dentro de un intervalo de 3,5 a 3,9, en donde la solución que comprende TACI-Fc obtenida al final de la etapa (b), comprende más de 93%, 94%, 95% o 96% de dímeros de TACI-Fc.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/050886.

Solicitante: MERCK SERONO S.A.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: CENTRE INDUSTRIEL 1267 COINSINS SUIZA.

Inventor/es: KORNMANN,HENRI, BAER,GIANNI.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 25 de Enero de 2008.

Clasificación PCT:

  • A61K38/04 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen hasta 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados (gastrinas A61K 38/16, somatostatinas A61K 38/31, melanotropinas A61K 38/34).
  • C07K1/22 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Cromatografía de afinidad o técnicas análogas basadas en procesos de absorción selectiva.
  • C07K14/705 C07K […] › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
  • C12N15/62 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2366593_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la purificación de proteínas. Más específicamente, se refiere a la purificación de TACI-Fc usando cuerpos grasos modificados genéticamente que expresan la proteína A.

Antecedentes de la invención

1. Proteínas de fusión Fc

Las proteínas de fusión Fc son proteínas quiméricas que consisten en una región efectora de una proteína, tal como

p. ej., la región de unión de un receptor, fusionada con la región Fc de una inmunoglobulina, que es con frecuencia una inmunoglobulina G (IgG). Las proteínas de fusión Fc se emplean mucho como agentes terapéuticos, ya que ofrecen ventajas conferidas por la región Fc, tales como:

- la posibilidad de purificación usando cromatografía de afinidad hacia la proteína A o la proteína G, con afinidades que varían según el isotipo de IgG. La IgG1, IgG2 e IgG4 humanas se unen fuertemente a la proteína A y todas las IgGs humanas, incluyendo la IgG3, se unen fuertemente a la proteína G; y

- una semivida incrementada en el sistema circulatorio, puesto que la región Fc se une al receptor natural FcRn que protege de la degradación lisosómica.

La semivida sérica y las funciones efectoras se pueden modular por modificación de la región Fc, para aumentar o reducir su unión a FcRn, a FcγRs y a C1q respectivamente, dependiendo del uso terapéutico destinado para la proteína de fusión Fc.

En la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a receptores de Fc (FcγRs) en la superficie de células inmunes efectoras, tales como células citotóxicas naturales y macrófagos, conduciendo a la fagocitosis o a la lisis de las células que son diana.

En la citotoxicidad dependiente del complemento, CDC, los anticuerpos destruyen las células que son dianas, desencadenando la cascada del complemento en la superficie celular. Las isoformas de IgG ejercen diferentes niveles de funciones efectoras que aumentan en el orden de IgG4 < IgG2 < IgG1 ≤ IgG3. La IgG1 humana muestra ADCC y CDC elevadas, y es la más adecuada para uso terapéutico contra agentes patógenos y células cancerosas.

Modificando las funciones efectoras se puede conseguir mediante modificación genética que la región Fc mejore o reduzca su unión a FcγRs o a los factores del complemento.

La unión de IgG a los FcγRs activadores (FcγRI, FcγRlla, FcγRllla y FcγRlllb) y a los FcγRs inhibidores (FcγRllb) o al primer componente del complemento (C1q), depende de residuos situados en la región bisagra y en el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son decisivas para la unión a FcγRs y al complemento C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4. Por ejemplo, la sustitución de residuos de IgG2 en las posiciones 233-236 en lgG1 humana, redujo enormemente la ADCC y la CDC (Armour y otros, 1999; Shields y otros, 2001).

Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de IgG y su efecto sobre la ADCC y la CDC se sometió a ensayo in vitro (Shields y otros, 2001; Steurer y otros, 1995). Particularmente, se refirió que una mutación a alanina en E333 incrementaba la ADCC y la CDC (Idusogie y otros, 2000; ldusogie y otros, 2001).

El aumento de la semivida sérica de una proteína de fusión Fc terapéutica es otro modo de mejorar su eficacia, permitiendo niveles más elevados en circulación, una administración menos frecuente y dosis reducidas. Esto se puede conseguir mejorando la unión de la región Fc a FcR neonatal (FcRn). FcRn, que se expresa en la superficie de células endoteliales, se une a IgG en una manera dependiente del pH y la protege de la degradación. Diversas mutaciones situadas en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, han mostrado que incrementan la semivida de IgG1 (Hinton y otros, 2004; Vaccaro y otros, 2005).

La Tabla 1 a continuación, resume algunas mutaciones conocidas de la región Fc de IgG (obtenida de la página de internet de Invivogen).

Tabla 1

d Fc modificado Isotipo de IgG Mutaciones Propiedades Beneficios potenciales Aplicaciones hIgG1e1 IgG1 humana T250Q/M428L Semivida plasmática incrementada Localización mejorada de la diana; eficacia incrementada; dosis o frecuencia de administración reducidas Vacunación; uso terapéutico hIgG1e2 IgG1 humana M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F Semivida plasmática incrementada Localización mejorada de la diana; eficacia incrementada; dosis o frecuencia de administración reducidas Vacunación; uso terapéutico hIgG1e3 IgG1 humana E233P/L234V/L235A/ΔG236 + A327G/A330S/P3 ADCC y CDC reducidas Acontecimientos adversos reducidos Uso terapéutico sin agotamiento celular hIgG1e4 IgG1 humana E33A ADCC y CDC incrementadas Eficacia incrementada Uso terapéutico sin agotamiento celular hIgG2e1 IgG2 humana K322A CDC reducida Acontecimientos adversos reducidos Vacunación; uso terapéutico

2. Purificación de las proteínas de fusión Fc

Las proteínas de fusión Fc tienen una importancia comercial importante como fármacos que generalmente se denominan “agentes biológicos”. Uno de los mayores desafíos es el desarrollo de procedimientos rentables y eficaces para la purificación de proteínas a escala comercial. Aunque muchos métodos están ahora disponibles para la preparación de proteínas a gran escala, productos brutos, tales como el material sobrenadante del cultivo celular, contienen no sólo el producto deseado sino también impurezas, que son difíciles de separar del producto deseado. Aunque el material sobrenadante del cultivo celular de las células que expresan productos proteicos recombinantes puede contener menos impurezas, si las células crecen en medio exento de suero, las proteínas de las células hospedadoras (HCPs) todavía se tienen que eliminar durante el procedimiento de purificación. Además, las autoridades sanitarias exigen unos niveles elevados de pureza para proteínas destinadas a la administración en seres humanos.

Muchos métodos de purificación contienen etapas que requieren la aplicación de un pH elevado o bajo, concentraciones elevadas de sal u otras condiciones extremas, que pueden comprometer la actividad biológica de una proteína dada. Así, para cualquier proteína es un desafío establecer un procedimiento de purificación que permita una pureza suficiente a la vez que mantiene la productividad del procedimiento en términos de precio por cantidad de proteína producida.

La purificación de las proteínas de fusión Fc se basa generalmente en la afinidad de la proteína de fusión Fc hacia otra proteína que está inmovilizada sobre una resina cromatográfica. Ejemplos de tales ligandos inmovilizados son las proteínas de la pared celular bacteriana, la Proteína A y la Proteína G, que tienen una especificidad hacia la porción Fc de determinadas inmunoglobulinas. Aunque la Proteína A y la Proteína G tienen una fuerte afinidad hacia los anticuerpos de IgG, tienen afinidades diversas hacia otras clases de inmunoglobulinas y también de isotipos.

La Proteína A es una proteína de 43.000 Dalton que es producida por la bacteria Staphylococcus aureus y contiene cuatro sitios de unión a las regiones Fc de IgG. La Proteína G se produce a partir del grupo G de estreptococos y tiene dos sitios de unión para la región Fc de IgG. Ambas proteínas se han caracterizado ampliamente por su afinidad hacia diferentes tipos de inmunoglobulinas. La Proteína L es otra proteína bacteriana, que se origina en Peptostreptococcus, que se une a inmunoglobulinas y a fragmentos de las mismas que contienen cadenas ligeras de Ig (Akerstrom y Bjorck, 1989).

La cromatografía de afinidad hacia la Proteína A, la Proteína G y la Proteína L se utiliza ampliamente para el aislamiento y la purificación de inmunoglobulinas. Puesto que los sitios de unión para la Proteína A y la Proteína G residen en la región Fc de una inmunoglobulina, la cromatografía de afinidad hacia la Proteína A y hacia la Proteína G, también permite la purificación de las proteínas denominadas de fusión Fc. Sin embargo, una purificación que implique una cromatografía de afinidad hacia la Proteína A, la Proteína G y la Proteína L es un procedimiento costoso y que requiere mucho tiempo.

Por lo tanto, existe una necesidad de lograr un método de purificación eficaz, sencillo y rentable para las proteínas de fusión Fc.

3. La tecnología de cuerpos grasos

El documento de patente de los EE.UU.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para purificar una proteína TACI-Fc, que comprende las etapas de:

a) mezclar una solución que comprende cuerpos grasos asociados a una proteína A con una muestra que comprende dicha proteína TACI-Fc a fin de obtener una relación final en mg de proteína TACI-Fc por mg de peso seco de cuerpos grasos, dentro de un intervalo desde 1 hasta de 5,5; y

b) separar dichos cuerpos grasos con proteína A de dicha proteína TACI-Fc añadiendo una solución acuosa que tiene un pH comprendido dentro de un intervalo de 3,5 a 3,9,

en donde la solución que comprende TACI-Fc obtenida al final de la etapa (b), comprende más de 93%, 94%, 95% o 96% de dímeros de TACI-Fc.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína TACI-Fc presenta una secuencia idéntica, en al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% a SEQ ID NO: 2, preferentemente en donde dicha proteína TACI-Fc tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa de lavado de dichos cuerpos grasos con proteína A antes de realizar la etapa (a), y/o que comprende adicionalmente la etapa de lavado de dichos cuerpos grasos con proteína A entre la etapa (a) y la etapa (b).

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los cuerpos grasos con proteína A se lavan con un tampón fosfato a un pH de 7.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde dicha etapa de lavado de dichos cuerpos grasos con proteína A se repite dos o tres veces.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha relación final de mg de proteína TACI-Fc por mg en peso seco de cuerpos grasos de la etapa (a), está dentro del intervalo de 3,5 a 5.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa (b) se realiza añadiendo una solución acuosa que tiene un pH de 3,5.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha solución acuosa comprende acetato 200 mM.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa (b) se repite dos

o tres veces.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una etapa (c) de filtración de la solución que comprende dicha proteína TACI-Fc obtenida al final de la etapa (b).

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una etapa (d) de neutralización de la solución obtenida al final de la etapa (c).

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una o varias etapas de pulido.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína TACI-Fc se formula adicionalmente en una composición farmacéutica.


 

Patentes similares o relacionadas:

Tratamiento, del 19 de Febrero de 2019, de Yaqrit Limited: Un antagonista del receptor de tipo Toll 4 (TLR4) para su uso en un método de tratamiento o prevención de disfunción renal en un individuo […]

Compuestos de balanol para su uso en el tratamiento de dolor, del 17 de Enero de 2019, de THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK: Uso de un agente que tiene la fórmula I**Fórmula** en la que n es 1, 2 o 3; Z es N o CH; en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:**Fórmula** […]

Composiciones y procedimientos de transfección de polinucleótidos, del 12 de Diciembre de 2018, de WASHINGTON UNIVERSITY: Una composición farmacéutica que comprende un complejo péptido-polinucleótido, comprendiendo el complejo péptido-polinucleótido una relación molar de péptido:polinucleótido […]

Uso de hepcidina para preparar un medicamento para tratar trastornos de la homeostasis del hierro, del 7 de Diciembre de 2018, de INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM): Polipéptido para su uso en un procedimiento de tratamiento para reducir la sobrecarga de hierro, en el que el polipéptido comprende una secuencia de 20 aminoácidos que tiene: […]

Agentes para mejorar la administración de fármacos, del 21 de Noviembre de 2018, de THE UNIVERSITY OF BATH: Un péptido que comprende una secuencia de acuerdo con la Fórmula 2 X5-X6-X7-X8 Fórmula 2 (Id. de Sec. nº: 2) en la que: X5 es cualquier […]

Péptidos permeables celulares inhibidores de la ruta de transducción de la señal JNK para su uso en el tratamiento de enfermedades oculares inflamatorias, del 30 de Octubre de 2018, de Xigen Inflammation Ltd: (Poli)péptido quimérico que comprende un (poli)péptido inhibidor de JNK para su uso en el tratamiento de la inflamación intraocular después de una cirugía […]

Análogos de péptidos gip, del 15 de Octubre de 2018, de UNIVERSITY OF COPENHAGEN: Un péptido seleccionado del grupo que consiste en EGTFISDYSIAMX0aX0bIX1QQDFVNWLLAQX2 (GIP3-30; SEQ ID NO: 74), GTFISDYSIAMX0aX0bIX1QQDFVNWLLAQX2 (GIP4-30; […]

Inhibidor de cinasas basado en péptidos de permeación celular, del 9 de Octubre de 2018, de PURDUE RESEARCH FOUNDATION: Una composición inhibidora de cinasa para su uso en un método de tratamiento de un trastorno inflamatorio con una fisiopatología que comprende la expresión inflamatoria […]

Otras patentes de MERCK SERONO S.A