Un método para purificar una proteína TACI-Fc, que comprende las etapas de:

a) mezclar una solución que comprende cuerpos grasos asociados a una proteína A con una muestra que comprende dicha proteína TACI-Fc a fin de obtener una relación final en mg de proteína TACI-Fc por mg de peso seco de cuerpos grasos, dentro de un intervalo desde 1 hasta de 5,5; y b) separar dichos cuerpos grasos con proteína A de dicha proteína TACI-Fc añadiendo una solución acuosa que tiene un pH comprendido dentro de un intervalo de 3,5 a 3,9, en donde la solución que comprende TACI-Fc obtenida al final de la etapa (b), comprende más de 93%, 94%, 95% o 96% de dímeros de TACI-Fc.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la purificación de proteínas. Más específicamente, se refiere a la purificación de TACI-Fc usando cuerpos grasos modificados genéticamente que expresan la proteína A.

Antecedentes de la invención

1. Proteínas de fusión Fc

Las proteínas de fusión Fc son proteínas quiméricas que consisten en una región efectora de una proteína, tal como

p. ej., la región de unión de un receptor, fusionada con la región Fc de una inmunoglobulina, que es con frecuencia una inmunoglobulina G (IgG). Las proteínas de fusión Fc se emplean mucho como agentes terapéuticos, ya que ofrecen ventajas conferidas por la región Fc, tales como:

- la posibilidad de purificación usando cromatografía de afinidad hacia la proteína A o la proteína G, con afinidades que varían según el isotipo de IgG. La IgG1, IgG2 e IgG4 humanas se unen fuertemente a la proteína A y todas las IgGs humanas, incluyendo la IgG3, se unen fuertemente a la proteína G; y

- una semivida incrementada en el sistema circulatorio, puesto que la región Fc se une al receptor natural FcRn que protege de la degradación lisosómica.

La semivida sérica y las funciones efectoras se pueden modular por modificación de la región Fc, para aumentar o reducir su unión a FcRn, a FcγRs y a C1q respectivamente, dependiendo del uso terapéutico destinado para la proteína de fusión Fc.

En la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a receptores de Fc (FcγRs) en la superficie de células inmunes efectoras, tales como células citotóxicas naturales y macrófagos, conduciendo a la fagocitosis o a la lisis de las células que son diana.

En la citotoxicidad dependiente del complemento, CDC, los anticuerpos destruyen las células que son dianas, desencadenando la cascada del complemento en la superficie celular. Las isoformas de IgG ejercen diferentes niveles de funciones efectoras que aumentan en el orden de IgG4 < IgG2 < IgG1 ≤ IgG3. La IgG1 humana muestra ADCC y CDC elevadas, y es la más adecuada para uso terapéutico contra agentes patógenos y células cancerosas.

Modificando las funciones efectoras se puede conseguir mediante modificación genética que la región Fc mejore o reduzca su unión a FcγRs o a los factores del complemento.

La unión de IgG a los FcγRs activadores (FcγRI, FcγRlla, FcγRllla y FcγRlllb) y a los FcγRs inhibidores (FcγRllb) o al primer componente del complemento (C1q), depende de residuos situados en la región bisagra y en el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son decisivas para la unión a FcγRs y al complemento C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4. Por ejemplo, la sustitución de residuos de IgG2 en las posiciones 233-236 en lgG1 humana, redujo enormemente la ADCC y la CDC (Armour y otros, 1999; Shields y otros, 2001).

Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de IgG y su efecto sobre la ADCC y la CDC se sometió a ensayo in vitro (Shields y otros, 2001; Steurer y otros, 1995). Particularmente, se refirió que una mutación a alanina en E333 incrementaba la ADCC y la CDC (Idusogie y otros, 2000; ldusogie y otros, 2001).

El aumento de la semivida sérica de una proteína de fusión Fc terapéutica es otro modo de mejorar su eficacia, permitiendo niveles más elevados en circulación, una administración menos frecuente y dosis reducidas. Esto se puede conseguir mejorando la unión de la región Fc a FcR neonatal (FcRn). FcRn, que se expresa en la superficie de células endoteliales, se une a IgG en una manera dependiente del pH y la protege de la degradación. Diversas mutaciones situadas en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, han mostrado que incrementan la semivida de IgG1 (Hinton y otros, 2004; Vaccaro y otros, 2005).

La Tabla 1 a continuación, resume algunas mutaciones conocidas de la región Fc de IgG (obtenida de la página de internet de Invivogen).

Tabla 1

2. Purificación de las proteínas de fusión Fc

Las proteínas de fusión Fc tienen una importancia comercial importante como fármacos que generalmente se denominan “agentes biológicos”. Uno de los mayores desafíos es el desarrollo de procedimientos rentables y eficaces para la purificación de proteínas a escala comercial. Aunque muchos métodos están ahora disponibles para la preparación de proteínas a gran escala, productos brutos, tales como el material sobrenadante del cultivo celular, contienen no sólo el producto deseado sino también impurezas, que son difíciles de separar del producto deseado. Aunque el material sobrenadante del cultivo celular de las células que expresan productos proteicos recombinantes puede contener menos impurezas, si las células crecen en medio exento de suero, las proteínas de las células hospedadoras (HCPs) todavía se tienen que eliminar durante el procedimiento de purificación. Además, las autoridades sanitarias exigen unos niveles elevados de pureza para proteínas destinadas a la administración en seres humanos.

Muchos métodos de purificación contienen etapas que requieren la aplicación de un pH elevado o bajo, concentraciones elevadas de sal u otras condiciones extremas, que pueden comprometer la actividad biológica de una proteína dada. Así, para cualquier proteína es un desafío establecer un procedimiento de purificación que permita una pureza suficiente a la vez que mantiene la productividad del procedimiento en términos de precio por cantidad de proteína producida.

La purificación de las proteínas de fusión Fc se basa generalmente en la afinidad de la proteína de fusión Fc hacia otra proteína que está inmovilizada sobre una resina cromatográfica. Ejemplos de tales ligandos inmovilizados son las proteínas de la pared celular bacteriana, la Proteína A y la Proteína G, que tienen una especificidad hacia la porción Fc de determinadas inmunoglobulinas. Aunque la Proteína A y la Proteína G tienen una fuerte afinidad hacia los anticuerpos de IgG, tienen afinidades diversas hacia otras clases de inmunoglobulinas y también de isotipos.

La Proteína A es una proteína de 43.000 Dalton que es producida por la bacteria Staphylococcus aureus y contiene cuatro sitios de unión a las regiones Fc de IgG. La Proteína G se produce a partir del grupo G de estreptococos y tiene dos sitios de unión para la región Fc de IgG. Ambas proteínas se han caracterizado ampliamente por su afinidad hacia diferentes tipos de inmunoglobulinas. La Proteína L es otra proteína bacteriana, que se origina en Peptostreptococcus, que se une a inmunoglobulinas y a fragmentos de las mismas que contienen cadenas ligeras de Ig (Akerstrom y Bjorck, 1989).

La cromatografía de afinidad hacia la Proteína A, la Proteína G y la Proteína L se utiliza ampliamente para el aislamiento y la purificación de inmunoglobulinas. Puesto que los sitios de unión para la Proteína A y la Proteína G residen en la región Fc de una inmunoglobulina, la cromatografía de afinidad hacia la Proteína A y hacia la Proteína G, también permite la purificación de las proteínas denominadas de fusión Fc. Sin embargo, una purificación que implique una cromatografía de afinidad hacia la Proteína A, la Proteína G y la Proteína L es un procedimiento costoso y que requiere mucho tiempo.

Por lo tanto, existe una necesidad de lograr un método de purificación eficaz, sencillo y rentable para las proteínas de fusión Fc.

3. La tecnología de cuerpos grasos

El documento de patente de... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar una proteína TACI-Fc, que comprende las etapas de:

a) mezclar una solución que comprende cuerpos grasos asociados a una proteína A con una muestra que comprende dicha proteína TACI-Fc a fin de obtener una relación final en mg de proteína TACI-Fc por mg de peso seco de cuerpos grasos, dentro de un intervalo desde 1 hasta de 5,5; y

b) separar dichos cuerpos grasos con proteína A de dicha proteína TACI-Fc añadiendo una solución acuosa que tiene un pH comprendido dentro de un intervalo de 3,5 a 3,9,

en donde la solución que comprende TACI-Fc obtenida al final de la etapa (b), comprende más de 93%, 94%, 95% o 96% de dímeros de TACI-Fc.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína TACI-Fc presenta una secuencia idéntica, en al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% a SEQ ID NO: 2, preferentemente en donde dicha proteína TACI-Fc tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa de lavado de dichos cuerpos grasos con proteína A antes de realizar la etapa (a), y/o que comprende adicionalmente la etapa de lavado de dichos cuerpos grasos con proteína A entre la etapa (a) y la etapa (b).

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los cuerpos grasos con proteína A se lavan con un tampón fosfato a un pH de 7.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde dicha etapa de lavado de dichos cuerpos grasos con proteína A se repite dos o tres veces.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha relación final de mg de proteína TACI-Fc por mg en peso seco de cuerpos grasos de la etapa (a), está dentro del intervalo de 3,5 a 5.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa (b) se realiza añadiendo una solución acuosa que tiene un pH de 3,5.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha solución acuosa comprende acetato 200 mM.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa (b) se repite dos

o tres veces.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una etapa (c) de filtración de la solución que comprende dicha proteína TACI-Fc obtenida al final de la etapa (b).

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una etapa (d) de neutralización de la solución obtenida al final de la etapa (c).

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente una o varias etapas de pulido.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína TACI-Fc se formula adicionalmente en una composición farmacéutica.