PRUEBA ANALÍTICA SÁNDWICH PARA DETERMINAR NT-proBNP.

Elemento de ensayo en forma de una tira de ensayo inmunográfica que funciona según el principio sándwich,

caracterizado porque el elemento de ensayo comprende como mínimo dos anticuerpos contra NT-proBNP, de los cuales al menos uno es un MAC, y los anticuerpos se hallan en las siguientes combinaciones: MAC 18.4.34 (27-31) con PAC (39-50) o PAC (38-42) o PAC (44-50); o MAC 18.4.34 (27-31) con MAC (38-42); o MAC 18.9.8 (27-31) con MAC (38-42), y uno de los anticuerpos está conjugado con un marcador particulado

Prueba analítica sándwich para determinar NT-proBNP.

La presente invención se refiere a una prueba analítica de tipo sándwich, en concreto a un elemento analítico, sobre todo en forma de una tira de ensayo inmunocromatográfica que trabaja según el principio sándwich, para determinar el péptido natriurético cerebral N-terminal (NT-proBNP).

El NT-proBNP es un marcador muy prometedor para diagnosticar y controlar la insuficiencia cardíaca. Un resumen sobre la insuficiencia cardíaca y la importancia del NT-proBNP como sustancia marcadora se encuentra, por ejemplo, en la patente WO 00/45176 páginas 1 a 4. Además los documentos WO 00/35951, US 5,786,163, US 6,461,828, US 6,117,644, EP 1 151 304, WO 02/083913 y la solicitud de patente europea nº 03 010 591.0 de 12.5.2003 (Klemt y otros), publicada como WO 2004/099252 y WO 2004/099253, tratan del NT-proBNP, de anticuerpos para el mismo y de métodos para determinarlo.

Actualmente el único ensayo diagnóstico in vitro del NT-proBNP disponible en el mercado es el Elecsys® NT-proBNP-Test totalmente automatizado de Roche Diagnostics, que funciona en base a una reacción tipo sándwich con detección por electroquimioluminiscencia. Este ensayo está concebido para ser utilizado en grandes laboratorios centrales y su realización requiere, además de reactivos líquidos con dosificación exacta, un aparato relativamente complejo para dosificar los líquidos y detectar la señal luminiscente. Hoy en día no existe en el mercado un ensayo rápido de NT-proBNP que sea fácil de manejar para casos de emergencia y que dé una indicación visual, sin necesidad de un dispositivo de evaluación.

Los ensayos rápidos de sustancias inmunológicamente detectables son conocidos desde hace mucho tiempo para una serie de diversos parámetros, por ejemplo a través de las patentes WO 97/06439, EP 0 291 194, US 5,591,645, US 4,861,711, US 5,141,850, US 6,506,612, US 5,458,852, US 5,073,484. Para ello, en la mayoría de los casos, los reactivos de detección inmunológica (básicamente anticuerpos o antígenos marcados o no) se preparan en forma seca sobre un soporte al cual pueda aplicarse una muestra líquida (especialmente líquidos corporales como sangre, suero, plasma, orina, saliva, etc.). Es preferible que el soporte tenga actividad capilar, por ejemplo que sea una membrana o un soporte de plástico con canales capilares. En el mundo científico se habla a menudo de tiras o dispositivos de ensayo inmunocromatográficos.

En pacientes con disnea aguda es conveniente hacer lo más rápidamente posible una determinación de NT-proBNP, para excluir o diagnosticar una insuficiencia cardíaca como causa de la disnea e iniciar el tratamiento adecuado. Como el ensayo Elecsys® NT-proBNP solo puede realizarse en un laboratorio central, es muy difícil hacer una determinación rápida de NT-proBNP fuera de los horarios habituales. Por tanto sería ventajoso disponer de un ensayo rápido, justo para situaciones urgentes, que pudiera realizarse prontamente en tales casos, fuera de los horarios habituales. Este ensayo rápido debería garantizar los mismos márgenes y límites de referencia que el correspondiente método del laboratorio central (Elecsys® NT-proBNP), para que los resultados fueran compatibles - con independencia del tipo de ensayo realmente efectuado.

Los anticuerpos policlonales (PAC) usados en el ensayo Elecsys® NT-proBNP reconocen una fracción muy concreta del NT-proBNP (NT-proBNP "nativo"; véase solicitud de patente EP nº 03 010 591.0 del 12.5.2003 de Klemt y otros; así se reconocen los epítopos del NT-proBNP con los aminoácidos 1-21 (AS 1-21) y 39-50 (AS 39-50)). No obstante, se ha demostrado que estos anticuerpos policlonales son inapropiados para ensayos rápidos de NT-proBNP con marcadores particulados, como p.ej. oro coloidal, porque, debido a interacciones físico-químicas con los componentes del ensayo rápido (como p.ej. materiales soporte, matrices, etc.), dan desfavorablemente una señal muy variable, lo cual produce visibles oscilaciones cualitativas del ensayo entre una y otra carga.

Por consiguiente el objeto de la presente invención era resolver los inconvenientes del estado técnico, en concreto, proporcionando un ensayo rápido para la determinación del NT-proBNP, que pudiera elaborarse de modo reproducible y tuviera una buena correlación con el método de laboratorio.

Este objetivo se resuelve mediante el objeto de la presente invención.

La presente invención tiene por objeto un ensayo inmunológico, sobre todo en forma de ensayo rápido, como p.ej. un elemento analítico del tipo descrito en las reivindicaciones independientes de la patente. En las reivindicaciones dependientes se describen formas de ejecución preferidas.

Según la presente invención, la solución para elaborar un ensayo inmunológico en formato sándwich que tenga buena correlación con el método Elecsys® de referencia prevé el uso de una combinación especial de anticuerpos, incluyendo al menos dos anticuerpos contra NT-proBNP, de los cuales al menos uno es un anticuerpo monoclonal (MAC; en inglés: monoclonal antibody o MAB). Otro anticuerpo del ensayo sándwich según la presente invención puede ser también un MAC o un anticuerpo policlonal (PAC; en inglés: polyclonal antibody o PAB).

Se prefiere una combinación de anticuerpos que comprenda al menos un anticuerpo policlonal (PAC; en inglés: polyclonal antibody o PAB) y un anticuerpo monoclonal (MAC; en inglés: monoclonal antibody o MAB) (la llamada combinación PAC/MAC) contra NT-proBNP.

En los términos de esta solicitud de patente PAC (X-Y) significa un anticuerpo policlonal dirigido contra el epítopo del NT-proBNP con los aminoácidos X hasta Y. MAC (X-Y) es un respectivo anticuerpo monoclonal. AC (X-Y) designa en general un anticuerpo (p.ej. PAC o MAC) dirigido contra el epítopo del NT-proBNP con los aminoácidos X hasta Y.

El MAC a.b.c. (X-Y) es un anticuerpo monoclonal obtenido de la línea celular depositada a.b.c., que va dirigido contra el epítopo del NT-proBNP con los aminoácidos X hasta Y.

Para garantizar que la calidad del conjugado anticuerpo-marcador sea reproducible, el MAC se inmoviliza preferiblemente sobre el marcador particulado, concretamente sobre un marcador de oro. Otros marcadores particulados adecuados son, por ejemplo, látex teñidos, otros marcadores de sol metálico, marcadores poliméricos o nanocristales semiconductores (los llamados puntos cuánticos). El conjugado MAC-marcador se dispone preferiblemente sobre el dispositivo de ensayo rápido de modo pueda separarse de éste mediante la muestra líquida, por ejemplo impregnando materiales soporte adecuados como vellos, membranas, etc. Sin embargo el conjugado MAC-marcador también puede añadirse al ensayo rápido en forma disuelta.

El PAC, que se obtiene preferentemente por inmunización de mamíferos, en especial ovejas, cabras o conejos, se ofrece preferiblemente como derivado de biotina en el ensayo rápido y puede estar unido a una tira de detección de avidina o de estreptavidina. Sin embargo el PAC también se puede inmovilizar directamente en el dispositivo de ensayo, por ejemplo en forma de una capa de detección sobre una membrana cromatográfica adecuada.

El MAC usado según la presente invención no debe identificar forzosamente el epítopo (AS 1-21) reconocido en el sistema de referencia (Elecsys® Test) para garantizar una buena correlación con el ensayo de referencia: las combinaciones de anticuerpos mencionadas en la reivindicación 1, sobre todo la combinación MAC/PAC MAC 18.4.34(27-31)/PAC (39-50), muestran buena correlación con el sistema de referencia Elecsys®, en el cual se usan anticuerpos policlonales contra los epítopos AS 1-21 y AS 39-50 del NT-proBNP (PAC (1-21) y PAC (39-50)).

Los anticuerpos policlonales, por ejemplo PAC (39-50), se pueden obtener, caracterizar e identificar por métodos ya conocidos del especialista, especialmente por analogía con el ejemplo 2 de la patente WO 00/45176.

Los anticuerpos monoclonales, por ejemplo MAC (38-42) y MAC (44-50), se pueden obtener, caracterizar e identificar por métodos ya conocidos del especialista, especialmente por analogía con el ejemplo 3 de la patente WO 00/45176 o con el ejemplo 3 de la solicitud de patente EP nº 03 010 591.0, de 12.5.2003 (Klemt y otros).

La marcación de los anticuerpos, por ejemplo con oro u otros marcadores, biotina, etc., se realiza según los métodos ya conocidos del especialista (véase también a...

1. Elemento de ensayo en forma de una tira de ensayo inmunográfica que funciona según el principio sándwich, caracterizado porque el elemento de ensayo comprende como mínimo dos anticuerpos contra NT-proBNP, de los cuales al menos uno es un MAC, y los anticuerpos se hallan en las siguientes combinaciones: